楊長庚，文 華，王美姿，陸 星，蔣 明，田 娟，喻麗娟

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢430223；2.嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東湛江 524048)

環(huán)境因子例如溫度、光照、鹽度、溶解氧等能夠制約魚類的生長繁殖[1]。其中，溫度對魚類生長發(fā)育的影響尤為明顯。針對溫度對魚類生理影響的研究從魚類的形態(tài)、生理、生化到分子等各個方面均有研究[2-5]。

羅非魚(Oreochromisniloticus， tilapia)，原產(chǎn)于非洲，屬鱸形目麗魚科羅非魚屬，為溫水魚類，其生長溫度范圍為16～38 ℃，適溫范圍22～35 ℃，耐低溫能力較差[6]，是僅次于鯉科和鮭科魚類的世界第三大養(yǎng)殖品種，在熱帶和亞熱帶地區(qū)具有廣泛的養(yǎng)殖[7]。目前，中國已成為世界最大的羅非魚養(yǎng)殖國家。然而，受其耐低溫能力差的影響，我國羅非魚的養(yǎng)殖受到氣候與溫度的制約，導(dǎo)致了其南北地理位置分布極不均衡。因此，如何提高羅非魚耐低溫能力已成為其增養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展所面臨的重要問題之一。目前，已有一些關(guān)于低溫對羅非魚的影響以及羅非魚耐低溫性能的研究[8-9]。而針對羅非魚的影響，前期，我們從低溫脅迫羅非魚的數(shù)字基因表達譜中篩選到一個受低溫脅迫影響的基因-生長抑制特異性基因2(growth arrest specific 2 gene， Gas2)[10]。Gas2是微絲系統(tǒng)的組成成分，在進化過程中高度保守，主要起著在凋亡過程中調(diào)節(jié)微絲和細胞形態(tài)變化作用[11-12]。此外，P53基因能與細胞骨架相互作用[13-14]，P53基因又是一種腫瘤抑制基因，能夠促進細胞凋亡。由此，本研究利用Gas2基因的shRNA(short hairpin RNA)轉(zhuǎn)染羅非魚腎臟細胞系，并對轉(zhuǎn)染后的羅非魚腎臟細胞進行低溫脅迫，通過檢測Gas2基因及P53 mRNA的表達變化、以及低溫脅迫下細胞的增殖及凋亡情況，從而進一步認識TLGas2(Tilapia Gas2)基因的功能，加深我們對羅非魚在低溫脅迫下的響應(yīng)機制的理解，為培育耐低溫羅非魚以及研制抗低溫基因產(chǎn)品等提供重要的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

羅非魚腎臟細胞系(SKC)(長江水產(chǎn)研究所保藏，中國)；pGPU6/ GFP/Neo-gas2 shRNA 載體(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，中國)；MEM 培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco公司，美國)，LipofectaminTM 2000試劑盒(Invitrogen公司，美國)；WST-1細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，中國)，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，中國)；TRIzolReagent (Invitrogen 公司，美國)；FastKing RT Kit (With gDNase)(天根生化科技(北京)有限公司，中國)；FastFire qPCR PreMix (SYBR Green)(天根生化科技(北京)有限公司，中國)。

1.2 方法

1.2.1 short hairpin RNA (shRNA)表達載體選擇

根據(jù)Gas2基因序列設(shè)計三條shRNA序列。委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司使用pGPU6/Neo載體構(gòu)建shRNA表達質(zhì)粒(shG1， shG2， and shG3)。根據(jù)前期轉(zhuǎn)染羅非魚腎臟細胞系檢測干擾效率，篩選出shG3載體[15]。shRNA序列如下：5′ GATCCAAAAAAGCCAATGATCCACCTTGCAGATCTCTTGA

ATCTGCAAGGTGGATCATTGGC 3′。

1.2.2 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及低溫脅迫

將羅非魚腎臟細胞(TKC)常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中，置于細胞培養(yǎng)箱中25 ℃進行培養(yǎng)。培養(yǎng)TKC細胞至對數(shù)生長期，調(diào)整細胞密度，分別接種于6孔板(用于提取mRNA)，24孔板(用于細胞凋亡檢測)或96孔板(用于細胞增殖檢測)中。當融合度為80%左右時按LipofectaminTM 2000試劑盒說明書進行轉(zhuǎn)染，在25 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)。設(shè)置陰性對照組(Nc)及Gas2干擾組(RNAI)，分別轉(zhuǎn)染shNc對照質(zhì)粒和shG3干擾質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染24 h后，按照5 ℃/d的降溫速率，將培養(yǎng)溫度降至10 ℃。分別在25 ℃，20 ℃，15 ℃，10 ℃檢測Gas2基因和P53基因mRNA表達以及細胞增殖、凋亡情況。

1.2.3 總RNA提取、cDNA合成

分別在不同處理溫度下將6孔板中細胞去其上清，用PBS洗兩次后，每孔加TRIZOL試劑1 mL，消化5～10 min。小心吸取上清轉(zhuǎn)入新的EP 管，加入氯仿200 μL，混勻至乳白色，冰上靜置5 min，4 ℃，12 000 r/min離心15 min，小心吸取上清轉(zhuǎn)入新的EP 管，加入異丙醇500 μL，上下顛倒搖勻，冰上靜置10 min，4 ℃，12 000 r/min離心15 min，棄上清，向沉淀中加入75%乙醇1 mL，4 ℃，10 000 r/min離心5 min，棄上清，適當干燥，加入適量DEPC 水溶解，電泳檢測后-80 ℃保存?zhèn)溆谩７謩e以提取的總RNA 500 ng為模板，參照FastKing RT Kit (With gDNase)第一鏈合成試劑盒說明書合成cDNA。

1.2.4 實時熒光定量PCR

參照FastFire qPCR PreMix (SYBR Green)熒光定量預(yù)混試劑盒說明書，使用QuantStudio6 Flex系統(tǒng)進行實時熒光定量PCR，以18S RNA作為內(nèi)參基因，每個樣品設(shè)定3個重復(fù)，反應(yīng)體系：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，正、反向引物(10 μmol/L) 各0.6 μL，cDNA 模板2 μL，RNase-Free ddH2O補足到20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 15 min，1 個循環(huán)；95 ℃ 10 s，60 ℃ 32 s，72 ℃ 32 s，40 個循環(huán)。相對定量分析采用2-Δ ΔCt的方法。

1.2.5 細胞增殖及凋亡檢測

按照WST-1細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒說明書，孵育2 h后，分別對不同溫度處理下細胞樣品，每個樣品設(shè)定3個重復(fù)，利用酶標儀BioTek Synergy2在450 nm測定吸光度。

按照Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明書，室溫(20～25 ℃)避光孵育20分鐘，分別對不同溫度處理下細胞樣品，利用流式細胞儀(Beckman CytoFLEX FCM)檢測細胞凋亡，計算凋亡比率。

1.2.6 統(tǒng)計分析

使用SPSS 18.0軟件中的單因素方差(One-way ANOVA)分析，分析各組數(shù)據(jù)的差異顯著與否，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 實時熒光定量PCR檢測Gas2及P53基因的mRNA表達情況

如圖1所示，低溫脅迫下，RNAI組與Nc組中Gas2、P53基因mRNA表達與25 ℃相比在15 ℃和10 ℃時均顯著升高。而RNAI組中P53基因mRNA的表達在20 ℃時與25 ℃相比變化不明顯。Nc組中Gas2、P53基因mRNA表達在20 ℃時與25 ℃相比均顯著升高。

在同一溫度下時，RNAI組Gas2、P53基因mRNA表達均顯著低與Nc組。

圖1 干擾Gas2基因的羅非魚腎臟細胞受低溫脅迫時Gas2、P53基因mRNA表達變化情況

2.2 低溫脅迫下抑制Gas2基因后細胞凋亡情況

隨溫度降低，RNAI組及Nc組的羅非魚腎臟細胞凋亡率均明顯升高。但是同時隨著溫度降低，與對照相比，RNAI組細胞凋亡率明顯低于Nc組。見圖2。

圖2 流式細胞儀檢測低溫脅迫下羅非魚腎臟細胞細胞凋亡情況

2.3 低溫脅迫下抑制Gas2基因后細胞增殖情況

圖3所示，隨溫度降低，RNAI組及Nc組的羅非魚腎臟細胞增殖率均顯著降低。在25 ℃及20 ℃時，RNAI組的細胞增殖率顯著低于Nc組，而在15 ℃時，RNAI組的細胞增殖率顯著高于Nc組。

圖3 低溫脅迫下羅非魚腎臟細胞在不同溫度下的增殖情況

3 討論

溫度尤其是低溫與生物體組織器官發(fā)育、機體正常生理活動維持、免疫抑制等生理過程有密切關(guān)系[9， 16-17]。低溫會造成魚類從生理生化到分子遺傳等多個方面的變化。例如：Carginale等[7]研究發(fā)現(xiàn)，南極巖石鱈魚通過兩種不同策略實現(xiàn)低溫下高效消化食物蛋白質(zhì)來適應(yīng)低溫環(huán)境：一是通過基因復(fù)制，提高酶產(chǎn)量以彌補在冷脅迫下轉(zhuǎn)錄效率的降低；另一個是通過表達一類在低溫下特異表達的低溫胃蛋白酶來提高食物的消化效率。Yao 等[18]2012 年對貽貝Mytilus edulis的研究結(jié)果表明，在貽貝中低溫脅迫與高溫應(yīng)激均依賴caspase-3，并提出在高溫以及低溫下的DNA 損傷與之后的應(yīng)激反應(yīng)(例如誘導(dǎo)細胞凋亡)之間存在必然的因果聯(lián)系。在細胞水平上，低溫脅迫可以導(dǎo)致細胞腫脹、膜破損，造成細胞壞死[19]，而且還能引發(fā)細胞內(nèi)一系列復(fù)雜的基因表達變化和生理反應(yīng)，抑制細胞增殖，使細胞周期發(fā)生改變，并誘導(dǎo)細胞凋亡[20-21]。細胞水平的影響主要包括低溫影響細胞膜流動性，物質(zhì)運輸，導(dǎo)致細胞停止分裂生長，并進入凋亡階段[22-23]。此外， 嚴文靜等[24]研究短蓋巨脂鯉Piaractus brachypomus發(fā)現(xiàn)， 低溫導(dǎo)致一些魚類細胞致死的途徑是細胞凋亡。而這一系列影響，是建立在分子水平影響上的。因此，從細胞凋亡相關(guān)基因入手研究低溫脅迫對魚類的影響是很有必要的。然而，低溫對羅非魚組織細胞學(xué)方面的研究資料較少。

生長抑制特異性基因2(growth arrest specific 2 gene，Gas2)，是微絲系統(tǒng)的組成成分，主要起著調(diào)節(jié)微絲和細胞形態(tài)變化作用[11， 25]。同時，Gas2基因又是一個多功能的基因，參與著細胞的凋亡過程，一方面作為凋亡的效應(yīng)分子，是caspase-3的底物，被caspase-3酶切，參與凋亡細胞的形態(tài)改變[12， 26]；另一方面，過表達的Gas2不直接引起細胞的凋亡，但是可以增加細胞對凋亡信號的敏感性[27]。我們的研究中，隨溫度降低，RNAI組及Nc組的羅非魚腎臟細胞凋亡率均明顯升高。并且在溫度降至20 ℃以下細胞明顯受到低溫脅迫時，抑制了Gas2基因的羅非魚腎臟細胞凋亡率與對照相比明顯下降。說明低溫不僅可以引起細胞的壞死，同時也能引起細胞凋亡。同時Gas2基因參與了細胞周期過程，在其中起到一定的作用，能夠引起細胞凋亡的發(fā)生。隨溫度降低，RNAI組及Nc組的羅非魚腎臟細胞增值率均顯著下降，也說明了低溫對正常細胞周期的負面影響。如圖3所示，Gas2干擾組與陰性對照組的羅非魚腎臟細胞的增殖水平在低溫脅迫下均顯著降低，但Gas2干擾組的下降趨勢與陰性對照組相比更為平緩，尤其在20～15 ℃區(qū)間的增殖水平降低較少。并且，在溫度降至20 ℃以下細胞明顯受到低溫脅迫時，抑制了Gas2基因后的羅非魚腎臟細胞其增殖率顯著高于對照組，更說明Gas2基因?qū)毎蛲龅恼{(diào)控作用，抑制Gas2基因后可以抑制細胞凋亡的發(fā)生。

已有研究發(fā)現(xiàn)Gas2在體內(nèi)與m鈣蛋白酶結(jié)合，抑制m鈣蛋白酶的活性，從而使P53穩(wěn)定性增加[27]。而P53基因是一種腫瘤抑制基因，其控制著細胞周期的啟動，能夠促進細胞凋亡。我們的研究中，P53基因的表達也隨著Gas2基因的表達發(fā)生變化。這可能是因為P53基因能與細胞骨架有相互作用[13-14]，而Gas2基因是微絲系統(tǒng)的組成成分，抑制Gas2基因后，同時也引起了P53基因的表達變化，降低P53基因表達，從而進一步影響細胞凋亡。

Gas2基因能夠影響P53基因表達，在羅非魚細胞凋亡過程中具有一定作用。抑制Gas2基因后，羅非魚腎臟細胞在受低溫脅迫時，能夠降低細胞的凋亡率，增加細胞的增殖。