王之遙， 李瑋珊， 李艾倫， 方 芳， 倉(cāng) 靜

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院麻醉科，上海 230032

神經(jīng)病理性疼痛是由各種原因?qū)е碌囊陨窠?jīng)病理性改變?yōu)橹鞯念B固性疼痛，主要表現(xiàn)為痛覺(jué)過(guò)敏、疼痛異常。其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，是疼痛治療的難點(diǎn)之一。目前臨床上常用的治療藥物包括抗抑郁藥、抗癲癇藥、阿片類鎮(zhèn)痛藥、局麻藥以及非甾體類抗炎藥等，治療效果均不理想[1]。二甲雙胍作為臨床上2型糖尿病治療的一線用藥，可達(dá)到良好的降糖效果且不良反應(yīng)少。近年來(lái)，二甲雙胍降糖以外的作用越來(lái)越被重視。已有研究[2-6]發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍具有抗炎、抗腫瘤以及調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等作用。臨床研究[7-8]表明，二甲雙胍作為輔助用藥聯(lián)合加巴噴丁和曲馬多對(duì)神經(jīng)病理性疼痛患者安全有效，但相關(guān)報(bào)道有限。本研究擬評(píng)價(jià)二甲雙胍治療單側(cè)坐骨神經(jīng)神經(jīng)慢性壓迫損傷(chronic constriction injury，CCI)誘發(fā)的大鼠神經(jīng)病理性疼痛的效應(yīng)，為臨床研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑 輻射熱測(cè)試儀購(gòu)自美國(guó)IITC Life Science公司，Von Frey纖毛購(gòu)自美國(guó)Stoelting公司，CatWalk步態(tài)分析系統(tǒng)購(gòu)自荷蘭Noldus公司。戊巴比妥鈉、二甲雙胍購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。丙酮溶液(純度>99.5%)購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司。

1.2 動(dòng)物分組及模型制備

1.2.1 動(dòng)物來(lái)源及飼養(yǎng) SPF級(jí)雌性SD大鼠初始體質(zhì)量180～200 g，7～9 周齡，由復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，以5只/籠飼養(yǎng)。所有動(dòng)物可在籠內(nèi)自由活動(dòng)、攝食和飲水。保持飼養(yǎng)環(huán)境溫度為23℃及相對(duì)恒定濕度；12 h晝夜循環(huán)光照并定期更換墊料。所有動(dòng)物在實(shí)施手術(shù)以及行為實(shí)驗(yàn)時(shí)均嚴(yán)格遵守國(guó)際疼痛研究學(xué)會(huì)(IASP)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。采用隨機(jī)數(shù)字表法，將其分為4組(n=12)：正常對(duì)照組(Naive組)、假手術(shù)組(Sham組)、CCI組和CCI+二甲雙胍組(Met組)。

1.2.2 神經(jīng)病理性疼痛模型的建立及給藥方法 根據(jù)Bennet和Xie[9]的方法建立坐骨神經(jīng)CCI模型。將大鼠稱質(zhì)量后，將4%戊巴比妥按0.2 mL/100 g的劑量進(jìn)行腹腔注射麻醉。大鼠采取側(cè)臥位，備皮并用乙醇消毒術(shù)區(qū)。在左側(cè)股骨下方約1 cm平行于股骨切開皮膚，鈍性分離肌肉暴露坐骨神經(jīng)；在神經(jīng)三支分叉以上的位置用4-0含鉻羊腸線結(jié)扎坐骨神經(jīng)4道，每道間隔約1 mm，保證結(jié)扎神經(jīng)的長(zhǎng)度為4～5 mm，結(jié)扎的松緊度以見(jiàn)周圍肌肉輕微抽動(dòng)為佳；逐層縫合肌肉層以及皮膚；最后再次消毒手術(shù)區(qū)域。Sham組僅暴露而不結(jié)扎坐骨神經(jīng)，其他組手術(shù)操作與CCI組相同。造模手術(shù)由同一人操作，以保證手術(shù)效果的均一性。Met組采用灌胃方式給藥，每次劑量45 mg/kg，從CCI建模前3 d開始給藥，每天上午 8：00至9：00和下午的6：00至7：00，持續(xù)至術(shù)后第7天。

1.3 疼痛行為學(xué)觀察 分別于建模前(基線，D0)，建模后第3、7、10、14天觀察并記錄大鼠傷口愈合情況及舔咬肢體、疼痛相關(guān)行為。根據(jù)文獻(xiàn)[10]采用Von Frey法測(cè)定機(jī)械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)： 在安靜舒適環(huán)境中將大鼠單獨(dú)放置于帶金屬網(wǎng)底(孔徑0.5 cm×0.5 cm)的透明有機(jī)玻璃籠內(nèi)，適應(yīng)30 min后用不同標(biāo)號(hào)的Von Frey絲(美國(guó)Stoeling公司)垂直刺激術(shù)側(cè)后足足底部，將Von Frey絲彎曲至約45°并持續(xù)3～5 s。記錄產(chǎn)生快速縮足、抬足、抖動(dòng)或舔舐反應(yīng)時(shí)對(duì)應(yīng)的Von Frey絲標(biāo)號(hào)。每種標(biāo)號(hào)的Von Frey絲均被測(cè)定至少出現(xiàn)3次陽(yáng)性反應(yīng)或3次無(wú)反應(yīng)，每次刺激均間隔至少10 s。逐漸增加刺激強(qiáng)度至同一標(biāo)號(hào)Von Frey絲出現(xiàn)至少3次陽(yáng)性反應(yīng)，記錄此時(shí)所用的Von Frey絲的標(biāo)號(hào)作為MWT。

1.4 熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawal latency, TWL)的測(cè)定 在安靜舒適環(huán)境中將大鼠單獨(dú)放置于透明有機(jī)玻璃籠內(nèi)，適應(yīng)30 min后用熱輻射疼痛刺激儀照射大鼠術(shù)側(cè)后足足底，在照射20 s內(nèi)當(dāng)產(chǎn)生快速縮足、揚(yáng)足或舔足反應(yīng)時(shí)立即停止照射，并記錄下此時(shí)照射的持續(xù)時(shí)間。重復(fù)測(cè)量5次，每次間隔至少5 min，將5次的持續(xù)照射時(shí)間取平均值作為TWL。

1.5 冷刺激誘發(fā)縮足次數(shù) (number of cold-stimulated paw withdrawal，TNCW)的測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[11]采用丙酮冷刺激法，在安靜舒適環(huán)境中將大鼠單獨(dú)放置于帶金屬網(wǎng)底(孔徑0.5 cm×0.5 cm)的透明有機(jī)玻璃籠內(nèi)，適應(yīng)30 min后用0.1 mL丙酮測(cè)定大鼠的疼痛反應(yīng)閾值。測(cè)定方法：用0.1 mL丙酮刺激術(shù)側(cè)后足足底部，記錄2 min內(nèi)大鼠所測(cè)后足的陽(yáng)性反應(yīng)次數(shù)。陽(yáng)性反應(yīng)為后足抬起、甩腿或舔足、拭足。測(cè)試3次，測(cè)試間隔時(shí)間至少5 min，將平均3次的陽(yáng)性反應(yīng)次數(shù)作為TNCW。

1.6 CatWalk步態(tài)測(cè)定 采用CatWalk步態(tài)分析系統(tǒng)對(duì)各組大鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)步態(tài)測(cè)定。大鼠在測(cè)試前預(yù)先放在測(cè)試環(huán)境中30 min，溫度控制在23℃左右，室內(nèi)開紅色光并保持安靜。調(diào)整攝像頭保證每次都能采集到至少4個(gè)站立時(shí)間。測(cè)試時(shí)，將大鼠放在CatWalk通道的一端，通道寬度設(shè)置為大鼠身寬的1.5倍，使大鼠自行走過(guò)，選取20 cm的距離進(jìn)行記錄，把通過(guò)時(shí)間控制在1～2 s。當(dāng)大鼠的腳掌與玻璃平板的表面接觸時(shí)，下方攝像頭即可捕捉到腳印圖像并傳送到計(jì)算機(jī)，通過(guò)相應(yīng)程序(Cat Walk XT 10.0)進(jìn)行分析。每只大鼠至少重復(fù)測(cè)試3次。合格的測(cè)試需滿足以下條件：腳印數(shù)≥10個(gè)，動(dòng)物總行走時(shí)間控制在1～8 s，速度方差小于60 cm/s。

足印面積指在站立時(shí)相腳掌接觸平板的總面積，與完整足印的平均強(qiáng)度均可反映行走時(shí)肢體的承重情況。而站立時(shí)間和擺動(dòng)時(shí)間與受累側(cè)肢體的疼痛和動(dòng)物的保護(hù)性行為相關(guān)。站立時(shí)間指大鼠腳掌每次接觸底板的時(shí)間。擺動(dòng)時(shí)間指大鼠腳掌2次接觸平板的間隔時(shí)間。另外記錄步周長(zhǎng)。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠建模情況 各組大鼠術(shù)后皮膚切口愈合良好，未發(fā)生舔咬肢體現(xiàn)象。大鼠CCI建模后3 d逐漸出現(xiàn)術(shù)側(cè)足趾并攏輕度外翻，后肢行走無(wú)力，呈跛行步態(tài)。結(jié)果(表1)表明：與Naive組相比，CCI組和Met組大鼠在建模后3 ～14 d左足MWT顯著降低(P<0.05)，Sham組左足MWT無(wú)明顯改變；與CCI組相比，Met組大鼠3～14 d左足MWT明顯升高(P<0.05)。

表1 各組大鼠左足機(jī)械縮足反射閾值 m/g

*P<0.05與Naive組比；△P<0.05與CCI組相比；▲P<0.05與D0相比

2.2 各組大鼠左足TWL的對(duì)比 結(jié)果(表2)表明：與Naive組相比，CCI組和Met組大鼠在建模后3～14 d左足TWL縮短(P<0.05)，Sham組TWL未見(jiàn)明顯改變；與CCI組相比，Met組大鼠3～14 d左足TWL明顯延長(zhǎng)(P<0.05)。

表2 各組大鼠左足熱縮足反射潛伏期 t/s

*P<0.05與Naive組比；△P<0.05與CCI組相比；▲P<0.05與D0相比

2.3 各組大鼠左足TNCW的對(duì)比 結(jié)果(表3)表明：與Naive組相比，CCI組和Met組大鼠在建模后3～14 d左足TNCW減少(P<0.05)，Sham組TNCW未見(jiàn)明顯改變；與CCI組相比，Met組大鼠3～14 d左足TNCW明顯增加(P<0.05)。

表3 各組大鼠左足冷刺激誘發(fā)縮足次數(shù) f/次

*P<0.05與Naive組比；△P<0.05與CCI組相比；▲P<0.05與D0相比

2.4 各組大鼠左側(cè)足印面積、完整足印的平均強(qiáng)度、站立時(shí)間及步周長(zhǎng)的對(duì)比 結(jié)果(表4)表明：與Naive相比，CCI組大鼠左側(cè)足印面積縮小、完整足印的平均強(qiáng)度減弱、站立時(shí)間縮短、步周長(zhǎng)減小、擺動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)，并持續(xù)至建模后第14 天(P<0.05)；Met組大鼠左側(cè)足印面積縮小、完整足印的平均強(qiáng)度減弱。與CCI組相比，Met組大鼠左側(cè)足印面積增加、完整足印的平均強(qiáng)度增強(qiáng)、站立時(shí)間延長(zhǎng)及步周長(zhǎng)增加(P<0.05)，擺動(dòng)時(shí)間無(wú)明顯改變。Sham組上述指標(biāo)在造模前后的各時(shí)間點(diǎn)均與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義。

表4 各組大鼠左側(cè)足印面積、完整足印的平均強(qiáng)度、站立時(shí)間、步周長(zhǎng)等的對(duì)比

*P<0.05與Naive組比；△P<0.05與CCI組相比；▲P<0.05與D0相比

3 討 論

坐骨神經(jīng)CCI大鼠模型是最經(jīng)典的神經(jīng)病理性疼痛動(dòng)物模型。該模型的優(yōu)點(diǎn)在于與神經(jīng)病理性疼痛患者的臨床表現(xiàn)接近，并且為選擇性的較粗的有髓鞘的神經(jīng)纖維損傷，而參與痛覺(jué)傳遞C纖維保留[9]。軸突損傷的異位放電和神經(jīng)結(jié)扎的炎性反應(yīng)共同導(dǎo)致疼痛的產(chǎn)生。此外，由于低齡和低體質(zhì)量的雌性大鼠對(duì)于傷害性刺激更為敏感[12-13]，故本研究選擇7～9周齡、體質(zhì)量180～200 g的雌性大鼠作為研究對(duì)象。行為學(xué)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Naive組相比，CCI組大鼠在建模后3 d左足MWT降低、TWL縮短、TNCW減少，而Sham組大鼠各指標(biāo)無(wú)明顯改變，提示大鼠CCI模型建立成功。

除機(jī)械和冷熱觸發(fā)痛之外，本研究還進(jìn)一步分析了CCI模型大鼠的步態(tài)變化。已有文獻(xiàn)[14-15]報(bào)道，CatWalk步態(tài)分析中的足印面積以及完整足印的平均強(qiáng)度等參數(shù)與Von Frey法檢測(cè)結(jié)果明顯相關(guān)，說(shuō)明其可作為一種更為客觀的方法評(píng)估疼痛行為，避免了Von Frey方法的主觀影響。本研究結(jié)果證實(shí)CCI組大鼠左側(cè)足印面積縮小、完整足印的平均強(qiáng)度減弱及站立時(shí)間縮短，而擺動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，CCI組大鼠的步周長(zhǎng)減小以及站立時(shí)間縮短，說(shuō)明造模后大鼠會(huì)由于患側(cè)后肢疼痛而減少該側(cè)肢體承重以及與地板接觸的時(shí)間，并且行走時(shí)步伐會(huì)縮短。

既往研究[16]顯示，磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase, AMPK)作為控制能量代謝的重要內(nèi)源性激酶在痛覺(jué)調(diào)節(jié)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，其經(jīng)典的激動(dòng)劑包括白藜蘆醇、二甲雙胍等。Inyang等[17]利用成年雄性BALB/c小鼠建立SNI神經(jīng)病理性疼痛小鼠模型，予以腹腔注射二甲雙胍，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍治療后的神經(jīng)病理性疼痛小鼠術(shù)側(cè)機(jī)械痛閾比給藥前明顯升高，提示二甲雙胍能減輕SNI神經(jīng)病理性疼痛雄性小鼠的痛覺(jué)。葛安琪等[18]發(fā)現(xiàn)，腹腔注射二甲雙胍可明顯逆轉(zhuǎn)骨癌痛大鼠的機(jī)械痛閾；二甲雙胍治療后，大鼠脊髓背角p-STAT3的表達(dá)顯著降低。Lu等[19]發(fā)現(xiàn)，在損傷神經(jīng)的周圍局部注射AMPK激動(dòng)劑也可升高神經(jīng)病理性疼痛大鼠的MWT，其治療作用可能與巨噬細(xì)胞釋放內(nèi)啡肽有關(guān)。然而，上述研究均僅對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠的機(jī)械痛閾進(jìn)行評(píng)估，方法較為單一。

本研究神經(jīng)病理性疼痛大鼠采取二甲雙胍灌胃的方法(模擬臨床常用的給藥方式)來(lái)進(jìn)行疼痛干預(yù)，并且對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)估。結(jié)果表明，二甲雙胍可緩解CCI誘發(fā)神經(jīng)病理性疼痛大鼠機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏，與既往研究結(jié)果相仿。此外，本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍同樣可以改善CCI大鼠的冷熱痛覺(jué)過(guò)敏及步態(tài)，說(shuō)明二甲雙胍可對(duì)不同種類的痛覺(jué)神經(jīng)通路產(chǎn)生抑制效應(yīng)。該效應(yīng)的機(jī)制可能為：一方面，二甲雙胍可通過(guò)激活中樞神經(jīng)細(xì)胞(小膠質(zhì)細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞)AMPK通路，抑制白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、IL-6等促炎介質(zhì)釋放，進(jìn)而產(chǎn)生中樞性鎮(zhèn)痛效應(yīng)；另一方面，二甲雙胍通過(guò)抑制細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)活性，降低電壓門控通道Nav1.7的磷酸化水平，減少損傷后外周神經(jīng)的異位放電，進(jìn)而減輕疼痛[20]。然而，二甲雙胍調(diào)控神經(jīng)病理性疼痛的具體機(jī)制及是否在神經(jīng)免疫方面產(chǎn)生影響，仍需進(jìn)一步證實(shí)。