孔琪 劉巖 劉治國 王曉慧 楊國仁

1 濟南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院 250000；2 山東大學(xué)附屬山東省腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，濟南 250117；3 青島市市立醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科 266011

細胞凋亡又稱細胞程序性死亡，即細胞在一定生理及病理條件下，通過一系列基因的激活、表達、調(diào)控，按照自身程序出現(xiàn)的主動性、生理性的死亡過程[1]。通過放化療等手段誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡是各種抗腫瘤治療的主要機制之一，而且細胞凋亡往往發(fā)生在腫瘤細胞死亡的早期階段。因此，可以通過檢測細胞凋亡評價抗腫瘤藥物的早期療效。

近年來，細胞凋亡探針成為研究熱點，尤其在腫瘤療效監(jiān)測方面受到更多關(guān)注。文獻報道最多的細胞凋亡分子探針為99Tcm-膜聯(lián)蛋白（Annexin V），但是該探針特異性差，不能區(qū)分細胞凋亡和壞死，且相對分子質(zhì)量大、藥代動力學(xué)差[2-4]，因此未能在臨床得到推廣。細胞凋亡的關(guān)鍵酶caspase-3 在凋亡早期階段被激活，可用于凋亡的早期評價。天冬氨酸-谷氨酸-纈氨酸-天冬氨酸（Asp-Glu-Val-Asp,DEVD）是caspase-3 的作用底物，能特異性地被caspase-3 裂解而滯留于凋亡細胞中，基于此原理，筆者初步合成了含DEVD 鏈的多肽分子探針99TcmCP3-peptide，并研究其在凋亡模型體內(nèi)外的生物學(xué)分布及SPECT 靜態(tài)顯像的初步分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

ZD-6000 型γ 計數(shù)器：西安志達科技有限公司； Discovery NM/CT670pro SPECT 儀：美 國GE 公司；E2695 高效液相色譜分析儀：美國Waters 公司；CytoFLEX 流式細胞儀：美國BD 公司；游標卡尺：美國Starrett 公司；電子天平（BT1250D）：北京賽多利斯有限公司。

紫杉醇（paclitaxel）：山東齊魯制藥有限公司；Annxin V-Flous 流式細胞凋亡檢測試劑盒：美國Roche 公司。

1.2 實驗細胞及實驗動物

肺腺癌A549 細胞由山東省腫瘤醫(yī)院提供。正常雄性裸鼠BALB/c 28 只，4 周齡，體質(zhì)量（21±2）g，由北京華阜康生物科技有限公司提供。實驗動物許可證號：SCXK（京）2014-0004。

1.3 分子探針99Tcm-CP3-peptide 的制備及質(zhì)量控制

在螯合劑聯(lián)肼尼克酰胺（HYNIC）的作用下完成對多肽的99Tcm標記。CP3-peptide 購自上海吉爾生化公司，其內(nèi)含有DEVD 核心，一端為HYNIC，一端為易滲透的聚乙二醇，共7 個氨基酸，相對分子質(zhì)量為1030。用溶劑為0.1 mol/L 的稀鹽酸配制成SnCl2緩沖液，濃度為0.65 mg/mL，蒸餾水配制Tricine 溶液，濃度為0.2 mg/mL，多肽CP3-peptide的濃度為0.2 mg/mL。在2 mL 微型離心管中加入SnCl2溶 液30 μL，多 肽 溶 液30 μL，輔 助 配 體Tricine 30 μL，高锝酸鈉溶液（約74 MBq）0.1 mL，加蒸餾水定容至1 mL，110℃加熱30 min。加熱結(jié)束后常溫放置即可。99Tcm-CP3-peptide 合成后，觀察產(chǎn)品顏色及澄清度，利用精密pH 試紙測量酸堿度，利用分析型高效液相色譜（high performance liquid chromatography,HPLC）儀分別于0、1、2、4 和6 h 測量放射化學(xué)純度（流動相為25%乙腈水溶液，0.1%三氟乙酸，流率為1 mL/min）。

1.4 99Tcm-CP3-peptide 的體外凋亡細胞結(jié)合實驗

收集對數(shù)生長期的肺腺癌A549 細胞，以5×104個/孔接種于2 個12 孔板，一個板為化療組，另一板為對照組，化療組與對照組均為3 組，每組2 孔，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育過夜。24 h 后，取出12 孔板，棄培養(yǎng)基，每孔加入500 μL PBS 沖洗2 遍，加入完全培養(yǎng)基（10%胎牛血清和1%雙抗的培養(yǎng)基）1 mL，化療組每孔均加入200 nmol/L紫杉醇，對照組每孔加入等量PBS，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育24 h 后，棄培養(yǎng)基，用500 μL PBS 沖洗2 遍。分別對化療組和對照組中的6 孔各加入99Tcm-CP3-peptide 0.37 MBq，靜置30 min 后加入500 μL PBS 沖洗2 遍，胰酶消化細胞后離心，800 r/min （離心半徑為8 cm），離心3 min，取上清液，用γ 計數(shù)儀測量細胞外放射性計數(shù)（Cout）；之后加入1 mol/L NaOH 100 μL裂解細胞，收集細胞裂解液測量細胞內(nèi)放射性計數(shù)（Cin）。同時處理另6 孔細胞，將其調(diào)整為5×105～1×106個/mL 單細胞懸液，應(yīng)用Annexin V-Flous 試劑盒進行Annexin V-異硫氰酸熒光素（FITC）及碘化丙啶（propidium iodine，PI）標記，采用流式細胞儀進行腫瘤細胞凋亡檢測。結(jié)果判定：Annexin VFITC 陰性/PI 陰性為正常細胞，Annexin V-FITC 陽性/PI 陰性為早期凋亡細胞，Annexin V-FITC 陽性/PI 陽性為晚期凋亡細胞，Annexin V-FITC 陰性/PI 陽性為壞死細胞。

1.5 肺腺癌A549 細胞荷瘤裸鼠模型的建立與99Tcm-CP3-peptide 體內(nèi)生物學(xué)分布

BALB/c 裸鼠28 只，將肺腺癌A549 細胞制備成單細胞懸液（1×107個/mL），接種于裸鼠右下肢，每只接種0.1 mL，10 d 后，待腫瘤直徑生長至1 cm 時，將荷瘤裸鼠模型進行實驗研究。

荷瘤裸鼠18 只，應(yīng)用隨機數(shù)字表法分為6 組，每組3 只，腹腔注射紫杉醇（40 mg/kg）48 h 后，尾靜脈注射99Tcm-CP3-peptide 3.7 MBq（約100 μL），分別于注射后5、15、30、60、120、240 min 各處死3 只，即刻取血液及心臟、肝臟、脾臟、腎臟等主要臟器，分別測量各臟器質(zhì)量及放射性計數(shù)，計算不同時間點的每克組織放射性攝取值（%ID/g）。

1.6 荷瘤裸鼠化療后SPECT 靜態(tài)顯像

10 只荷瘤裸鼠，分為化療組和對照組，每組5 只?；熃M腹腔注射紫杉醇（40 mg/kg），對照組腹腔注射相同體積的生理鹽水。48 h 后經(jīng)尾靜脈注射37 MBq99Tcm-CP3-peptide，于給藥后1 h 行SPECT 靜態(tài)顯像，條件為矩陣256×256，配備低能高分辨平行孔準直器，采集時間5 min。勾畫ROI，計算腫瘤和對側(cè)肌肉組織的放射性比值（T/NT）。

1.7 腫瘤組織形態(tài)學(xué)檢測

顯像結(jié)束后，取腫瘤組織即刻固定（10%中性甲醛溶液）、脫水、石蠟包埋后切成3～5 mm 薄片，常規(guī)蘇木精-伊紅染色后滴加樹脂封片，置于光學(xué)顯微鏡下（×400）觀察腫瘤細胞形態(tài)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊，以±s表示，兩組比較采用t檢驗，相關(guān)性研究采用雙變量相關(guān)分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 99Tcm-CP3-peptide 的制備及質(zhì)量控制

成功制備99Tcm-CP3-peptide，合成率為（64.5±5.2）%，產(chǎn)品為無色透明溶液，pH 值為6.5～7.5。99Tcm-CP3-peptide 標記率＞99%，放射性出峰時間為5.74 min，室溫放置0、1、2、4 和6 h 的放射化學(xué)純度分別為（99.33±0.12）%、（99.30±0.38）%、（99.02±0.13）%、（97.54±0.12）%和（97.02±0.26）%。

2.2 肺腺癌A549 細胞化療后99Tcm-CP3-peptide 攝取及流式細胞儀檢測結(jié)果

紫杉醇誘導(dǎo)肺腺癌A549 細胞凋亡后，用γ 計數(shù)器測定細胞及上清液的放射性計數(shù)，其中化療組Cin/Cout 為10.27±2.02，對照組Cin/Cout 為1.09±0.03，化療組為對照組的7.3 倍。腫瘤細胞凋亡檢測結(jié)果見圖1，由圖1可知，化療組細胞凋亡率為（75.62±2.57）%，對照組細胞凋亡率為（3.42±0.32）%，化療組細胞凋亡率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.97，P＜0.05）?；熃M和對照組的 Cin/Cout 與流式細胞儀檢測的凋亡細胞百分比呈正相關(guān)，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（r=0.970，P＜0.05）。

圖1 肺腺癌A549 細胞化療組與對照組細胞凋亡分析圖 圖中，A：化療組，細胞凋亡率為（76.52±2.57）%；B：對照組，細胞凋亡率為（3.42±0.32）%，化療組細胞凋亡率高于對照組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.97，P＜0.05）。FITC：異硫氰酸熒光素。 Fig.1 Apoptosis analysis of lung adenocarcinoma A549 cells in the chemotherapy group and the control group

2.3 99Tcm-CP3-peptide 在肺腺癌A549 細胞荷瘤裸鼠體內(nèi)的生物學(xué)分布結(jié)果

由表1可見，腎臟是99Tcm-CP3-peptide 放射性濃聚最多的器官，注射后15 min 達到峰值，為（8.95±0.51）%ID/g，2 h 為（2.25±0.78 ）%ID/g，清除較快；血液中放射性清除速度很快，到2 h 即下降到（2.25±0.24）%ID/g；腫瘤組織在注射后1 h 放射性攝取值達到峰值（4.26±1.03）%ID/g；心臟、脾臟、肺等重要器官放射性攝取值均較低；但在肝臟中攝取稍高：5 min 時為（3.21±0.75）%ID/g，到1 h時降為（2.81±0.72）%ID/g，下降速度較慢。

2.4 荷瘤裸鼠99Tcm-CP3-peptide SPECT靜態(tài)顯像結(jié)果

圖2顯示，注射99Tcm-CP3-peptide后1 h 即可獲得清晰圖像，化療組（圖2中A）腫瘤部位有明顯放射性攝取，對照組（圖2中B）腫瘤部位僅有少量放射性攝取?；熃MT/NT 為3.83±0.11，顯著高于對照組（1.57±0.09），且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=16.19，P＜0.05）。

2.5 腫瘤組織形態(tài)學(xué)檢測

光鏡下，腫瘤組織蘇木精-伊紅染色示化療組腫瘤組織（圖3中A）見大量核固縮（細胞核體積減小，嗜堿性增強）、核碎裂（核膜破裂，細胞核碎裂）及凋亡細胞（細胞體積縮小，胞質(zhì)致密，嗜酸性增強）；對照組（圖3中B）僅見少量核固縮、核碎裂及少量凋亡細胞。

3 討論

細胞凋亡是一系列基因、蛋白質(zhì)嚴密調(diào)控下的細胞自殺行為，細胞接受各種凋亡信號誘導(dǎo)，通過內(nèi)源性或外源性途徑激活凋亡相關(guān)酶或蛋白。Caspase 作為一組天門冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶，在細胞凋亡中起關(guān)鍵作用，其中與細胞凋亡相關(guān)的半胱氨酸蛋白

表1 不同時間99Tcm-CP3-peptide 在肺腺瘤A549 細胞荷瘤裸鼠體內(nèi)的生物學(xué)分布（ ±s，%ID/g）Table 1 Biological distribution of 99Tcm-CP3-peptide in nude mice with tumor at different time points ( ±s,%ID/g)

表1 不同時間99Tcm-CP3-peptide 在肺腺瘤A549 細胞荷瘤裸鼠體內(nèi)的生物學(xué)分布（ ±s，%ID/g）Table 1 Biological distribution of 99Tcm-CP3-peptide in nude mice with tumor at different time points ( ±s,%ID/g)

組織或器官 注射后時間5 min 15 min 30 min 60 min 120 min 240 min血液 10.51±3.21 9.50±2.71 6.34±1.24 4.25±1.02 2.25±0.24 2.65±1.31心臟 1.27±1.21 1.35±1.51 1.02±0.85 0.86±0.95 0.68±0.65 0.45±0.23肝臟 3.21±0.75 3.33±1.41 2.54±0.54 2.81±0.72 1.85±0.54 1.24±0.32脾臟 2.91±1.21 2.11±0.35 1.56±0.35 0.86±0.30 0.54±0.25 0.15±0.24腎臟 4.85±1.20 8.95±0.51 6.34±1.26 4.22±0.42 2.25±0.78 1.84±0.31肺2.67±1.01 2.31±0.85 1.85±0.62 1.32±0.21 1.15±0.78 0.65±0.33小腸 1.13±0.22 1.24±0.21 1.08±0.35 0.75±0.32 0.54±0.51 0.24±0.05肌肉 1.31±1.20 1.52±0.89 1.27±0.81 1.08±0.63 0.68±0.31 0.47±0.21骨骼 1.69±1.24 2.21±1.61 1.78±0.84 1.23±0.86 0.86±1.10 0.57±0.34腫瘤 2.75±0.31 3.21±1.03 3.73±0.84 4.26±1.03 3.21±0.96 1.30±0.56

圖2 肺腺瘤A549 細胞荷瘤裸鼠注射99Tcm-CP3-peptide 1 h后SPECT 靜態(tài)顯像圖 圖中，A：化療組，腫瘤區(qū)域可見放射性濃集（箭頭所示）；B：對照組，腫瘤區(qū)域僅可見少量放射性攝取（箭頭所示）。Fig.2 99Tcm-CP3-peptide SPECT static imaging of tumor-bearing nude mice

圖3 肺腺癌A549 細胞荷瘤裸鼠腫瘤組織病理圖（蘇木精-伊紅染色，×400） 圖中，A：化療組；B：對照組。黑箭頭表示核固縮，白箭頭表示核碎裂，三角形表示凋亡。 Fig.3 A549 lung cancer tumor-bearing nude mice tumor tissue sappanine-eosin staining figure

酶是caspase-2、3、7。caspase-3 是細胞凋亡過程中的關(guān)鍵元件，是細胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路，其激活與超常表達均引起細胞凋亡。當?shù)鞍姿饧壜?lián)反應(yīng)介導(dǎo)凋亡發(fā)生時，該酶參與凋亡起始、調(diào)節(jié)和執(zhí)行下游一系列酶聯(lián)反應(yīng)事件[5-6]，繼而發(fā)生磷脂酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺的外翻，最終細胞質(zhì)收縮、細胞膜破裂，形成凋亡小體。文獻報道的分子探針多為靶向細胞凋亡過程中磷酯酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺，如99Tcm-Annexin V，其在腫瘤化療[7-8]和放療[9-10]的療效評價和預(yù)測方面有一定應(yīng)用價值，但該探針特異性較差、相對分子質(zhì)量大、藥代動力學(xué)差，而且不能區(qū)分壞死和凋亡，因此限制了其在臨床上的應(yīng)用。

在細胞凋亡早期階段caspase-3 被激活，在細胞凋亡晚期或壞死時，其活性明顯下降，因此靶向caspase-3 既可用于檢測細胞凋亡的早期過程，也可在一定程度上區(qū)分細胞凋亡和壞死。張寶石等[11]研發(fā)含DEVD 核心的正電子核素標記的caspase-3多肽活性顯像劑，動物實驗結(jié)果表明，18F-CP-18比18F-FDG 能夠更早、更準確地反映腫瘤對化療所產(chǎn)生的凋亡反應(yīng)，但是后來的研究證明，腫瘤細胞的18F-CP-18 攝取值與caspase3表達程度的相關(guān)系數(shù)較低[12]。Shen 等[13]設(shè)計了一種新型細胞凋亡探針——18F-caspase3 敏感性納米聚合體示蹤劑（caspase-3 sensitive nano-aggregation tracer，CSNAT），因其具有強疏水性，可以原位組裝成高比活度的納米聚合物，不易被細胞排出，注射后凋亡細胞攝取值隨時間延長而增加，有利于增強PET 顯像的對比度；荷瘤裸鼠化療后18F-CSNAT 的腫瘤攝取、濃聚結(jié)合速率常數(shù)和腫瘤/肌肉攝取比值均顯著升高，但是18F-CSNAT 在腹腔的攝取較高，影響腹部腫瘤的顯像[14-15]。

在本研究中，99Tcm-CP3-peptide 作為一種新型99Tcm標記的細胞凋亡顯像劑成功制備，HPLC檢測結(jié)果示：99Tcm-CP3-peptide 標記率較高、穩(wěn)定性好，即刻放射化學(xué)純度達（99.33±0.12）%，且4 h放化純度仍高達（97.54±0.12）%，這表明該放射性藥物體外穩(wěn)定性較好，可以保持較高的放化純度；體外凋亡細胞化療組和對照組Cin/Cout 與流式細胞儀檢測的細胞凋亡呈正相關(guān)（r=0.970，P＜0.05），這表明99Tcm-CP3-peptide 能較好地靶向體外凋亡腫瘤細胞，可進一步用于動物細胞凋亡顯像研究；99Tcm-CP3-peptide 在正常小鼠體內(nèi)分布良好，腎臟在注射后15 min 達峰值（8.95±0.51）%ID/g，2 h后降為（2.25±0.78）%ID/g，清除較快，這表明此藥物主要經(jīng)腎臟排泄；注射顯像劑2 h 后，血液放射性攝取減少約為78.6%，這說明此放射性藥物在血液中清除較快，這些因素均有利于荷瘤裸鼠凋亡顯像。另外，小鼠在注射顯像劑1 h 后經(jīng)SPECT 顯像，勾畫ROI 示：化療組T/NT 為3.83±0.11，顯著高于對照組T/NT（1.57±0.09），兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=16.19，P＜0.05），與腫瘤組織的蘇木精-伊紅染色結(jié)果相符，提示腫瘤組織對該顯像劑的放射性攝取與細胞凋亡相關(guān)，但仍需后續(xù)的病理實驗如caspase-3 免疫組化、Tunel 等凋亡相關(guān)分析進一步驗證該相關(guān)性。以上研究結(jié)果提示，99Tcm-CP3-peptide 能夠較靈敏較早期地反映腫瘤細胞化療后的細胞凋亡情況。

本研究中，肝臟、腎臟攝取稍高，可能會影響動物腹部的顯像效果，有待動物實驗顯像的進一步研究。荷瘤裸鼠SPECT 靜態(tài)顯像發(fā)現(xiàn)，腫瘤對該顯像劑的攝取為局灶性，而非均勻性，可能因為化療后對腫瘤細胞殺傷是非均勻性的，與腫瘤的生長有關(guān)。此外實驗仍需對化療后荷瘤裸鼠在30、60、120、240 min 分別進行SPECT 顯像，以獲取最佳顯像的時間點。

綜上所述，99Tcm-CP3-peptide 作為一種新型細胞凋亡探針，其標記方法簡單、穩(wěn)定性好，且生物分布較理想，對監(jiān)測化療后腫瘤細胞凋亡的顯像具有潛在的價值，在化療療效預(yù)測方面有較好的應(yīng)用。后續(xù)的動物顯像實驗有待進一步研究。