許中衎 , 王黎霞 , 王 靜 , 李 暢 , 喬尚怡 , 張榕珍 ,張一弛 , 芳 卉 , 張建軍 , 安 健

(1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 國(guó)家級(jí)動(dòng)物類實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，北京昌平102206 ；2.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系，北京房山102442)

雞球蟲(chóng)病是由艾美耳屬的單種或多種雞球蟲(chóng)引起的主要侵襲雞腸道的全球性寄生蟲(chóng)病，是我國(guó)嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的常見(jiàn)疾病之一。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，全球養(yǎng)禽業(yè)每年因球蟲(chóng)感染造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)20億美元之多[1]。

迄今為止，防治雞球蟲(chóng)病仍以藥物治療為主，但隨著時(shí)間的積累，球蟲(chóng)表現(xiàn)出的耐藥性也逐步增強(qiáng)，而藥物殘留所帶來(lái)的危害也開(kāi)始引起人們的關(guān)注，這使得越來(lái)越多的研究人員將目光由控制、治療球蟲(chóng)病轉(zhuǎn)向免疫預(yù)防這條途徑[2]，研發(fā)新型疫苗成為預(yù)防雞球蟲(chóng)病的主要發(fā)展方向。頂復(fù)門原生寄生蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞的過(guò)程包括粘附、侵入、形成納蟲(chóng)空泡、寄生[3]。而參與以上過(guò)程的相關(guān)蛋白分子是眾多重要的雞球蟲(chóng)抗原，如棒狀體、微線體等蛋白，這些雞球蟲(chóng)抗原都或許可作為研制雞球蟲(chóng)病新型疫苗的候選因子[4-6]。本試驗(yàn)通過(guò)將E.tenella第二代裂殖子和MDBK細(xì)胞進(jìn)行無(wú)血清間接共培養(yǎng)，獲得了主要E.tenella多種外分泌性蛋白，接著對(duì)這些蛋白的理化性質(zhì)、信號(hào)肽等進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，預(yù)測(cè)其作為疫苗候選抗原的可能性。本次試驗(yàn)為分泌性蛋白的生物學(xué)功能研究奠定基礎(chǔ)，也為今后雞球蟲(chóng)病疫苗的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲(chóng)株E.tenellaB4株，由北京農(nóng)學(xué)院病理實(shí)驗(yàn)室提供，分離自昌平某雞場(chǎng)，復(fù)壯周期為3個(gè)月。

1.1.2 細(xì)胞 MDBK細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)室保存用于雞球蟲(chóng)研究的貼壁細(xì)胞系。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 1日齡農(nóng)大3號(hào)公雞雛，將其飼喂于無(wú)球蟲(chóng)及其他病原環(huán)境中，使用不含抗球蟲(chóng)藥的雛雞飼料，飼喂至14日齡，期間自由采食。

1.1.4 主要試劑 TRIzol,購(gòu)自美國(guó)Ambion公司；DNA Marker,購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒，購(gòu)自美國(guó)TaKaRa公司；2×TaqDNA聚合酶,購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶EcoR I/NotI、DNA連接酶，購(gòu)自美國(guó)NEB公司；E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞,購(gòu)自北京中美泰和生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1E.tenella第二代裂殖子的收集 取柔嫩艾美耳球蟲(chóng)孢子化卵囊按7×104/只接種7日齡無(wú)球蟲(chóng)雞；112 h后剖殺取盲腸，浸于洗脫液內(nèi)，剪開(kāi)盲腸，洗去盲腸內(nèi)容物；將剪開(kāi)的盲腸置于冰上，于洗脫液中刮下腸黏膜，統(tǒng)一收集以上洗脫液后勻漿，使裂殖子游離出來(lái)；200目和100目網(wǎng)篩過(guò)濾勻漿；將所得濾液1 500 r/min離心10 min，棄去上清，洗脫液重懸沉淀；600 r/min離心8 min，收集上清(因慢速離心下，質(zhì)量較大的紅細(xì)胞和雜質(zhì)會(huì)沉下，裂殖子會(huì)懸浮于上清液中，故收集上清)。上清經(jīng)1 500 r/min離心10 min，取沉淀；適量洗脫液重懸沉淀，置于42 ℃水浴中。裝柱：將配置好的DE-52纖維素(配制方法略)裝入直徑1 cm，高約30 cm的層析柱中至柱高4～5 cm。將裂殖子重懸液加入層析柱中，收集純化后的裂殖子。

1.2.2E.tenella與MDBK細(xì)胞的間接共培養(yǎng) 計(jì)數(shù)純化后的裂殖子1 200萬(wàn)個(gè)/孔， 置于42 ℃中保持活性，準(zhǔn)備好共培養(yǎng)；待MDBK細(xì)胞長(zhǎng)至80%鋪滿瓶底后，進(jìn)行細(xì)胞換液，將完全培養(yǎng)液換成無(wú)血清無(wú)雙抗的DMEM；放入Transwell；將含有裂殖子的洗脫液置于Transwell小室中，隔離共培養(yǎng)12 h，共重復(fù)3孔；取3孔上清液置于10 mL離心管中，置于-80 ℃冰箱保存，用于蛋白質(zhì)定性分析。

1.2.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析 將樣品(上清液)用蛋白酶降解，使得長(zhǎng)鏈的蛋白質(zhì)剪切成短鏈的肽段；酶解后的蛋白片段通過(guò)質(zhì)譜測(cè)定，選擇出離子豐度較高的肽段進(jìn)一步破碎得到各種碎片離子，再通過(guò)Mascot檢索軟件，與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)相對(duì)比進(jìn)行蛋白鑒定，確定蛋白。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 運(yùn)用SOPMA、TMHMM、Protscale、SignalP、抗原表位預(yù)測(cè)軟件和Phyre2.0等生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)這些蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、疏水性、信號(hào)肽、抗原表位和三維結(jié)構(gòu)等，預(yù)測(cè)其作為疫苗候選抗原的可能性。

2 結(jié)果

2.1E.tenella外分泌性蛋白的LC-MS/MS檢測(cè) 將液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)到的蛋白數(shù)據(jù)連接Mascot檢索軟件，圖1是Mascot檢索軟件打分結(jié)果，橫坐標(biāo)指匹配的蛋白得分，縱坐標(biāo)指匹配的蛋白數(shù)目，柱是指匹配的結(jié)果，陰影內(nèi)(蛋白得分<33)表示小于閾值分?jǐn)?shù)的不可信結(jié)果，即打分大于33分的蛋白99%以上為該蛋白。得分前4位蛋白如表1所示。

圖1 LC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果

表1 LC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果

2.2E.tenella外分泌性蛋白的生物信息學(xué)分析 利用SOPMA在線軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr)預(yù)測(cè)以上所得到的4種蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)得知，Hsp90中參與α-螺旋形成的氨基酸占50.98%，參與β-轉(zhuǎn)角形成的氨基酸占5.90%，參與延伸鏈形成的氨基酸占14.61%，參與無(wú)規(guī)則卷曲形成的氨基酸占28.51%；Histone 4中參與α-螺旋形成的氨基酸占46.60%，參與β-轉(zhuǎn)角形成的氨基酸占11.65%，參與延伸鏈形成的氨基酸占14.56%，參與無(wú)規(guī)則卷曲形成的氨基酸占27.18%；HP中參與α-螺旋形成的氨基酸占63.09%，參與β-轉(zhuǎn)角形成的氨基酸占8.72%，參與延伸鏈形成的氨基酸占3.36%，參與無(wú)規(guī)則卷曲形成的氨基酸占24.83%；Ribosomal protein中參與α-螺旋形成的氨基酸占23.26%，參與β-轉(zhuǎn)角形成的氨基酸占9.30%，參與延伸鏈形成的氨基酸占18.6%，參與無(wú)規(guī)則卷曲形成的氨基酸占48.84%。此外發(fā)現(xiàn)，4個(gè)蛋白均無(wú)β-折疊結(jié)構(gòu)(如表2)。

表2 外分泌性蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用TMHMM在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)對(duì)以上所得4種蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Hsp90(見(jiàn)中插彩版圖2左上)，Histone 4(見(jiàn)中插彩版圖2右上)，HP(見(jiàn)中插彩版圖2左下)和Ribosomal protein(見(jiàn)中插彩版圖2右下)的膜內(nèi)區(qū)域幾率均極低，說(shuō)明這4種蛋白均無(wú)跨膜區(qū)。

圖2 外分泌性蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域分析

利用Protscale在線軟件(https://web.expasy.org/protscale/)分析以上所得4種蛋白的疏水性質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Hsp90(圖3左上)多肽鏈，Histone 4(圖3右上)多肽鏈，HP(圖3左下)多肽鏈和Ribosomal protein(圖3右下)多肽鏈均具有極強(qiáng)的疏水性。

圖3 外分泌性蛋白的疏水性分析

利用SignalP在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對(duì)以上所得4種蛋白的信號(hào)肽進(jìn)行分析，結(jié)果分別得到：Hsp90(見(jiàn)中插彩版圖4左上)的C=0.139，S=0.788，Y=0.289，D=0.494，在第16和17位氨基酸之間有剪切位點(diǎn)的可能性較大，推斷Hsp90存在信號(hào)肽；Histone 4(見(jiàn)中插彩版圖4右上)的C=0.170，S=0.682，Y=0.313，D=0.459，在第17和18位氨基酸之間有剪切位點(diǎn)的可能性較大，推斷Histone 4存在信號(hào)肽；HP(見(jiàn)中插彩版圖4左下)的C=0.163，S=0.616，Y=0.256，D=0.369，推斷Hypothetical protein(HP)不存在信號(hào)肽；Ribosomal protein(見(jiàn)中插彩版圖4右下)的C=0.131，S=0.510，Y=0.212，D=0.292，推斷Ribosomal protein不存在信號(hào)肽。

圖4 外分泌性蛋白的信號(hào)肽分析

利用Immunomedicine Group在線軟件(http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl)預(yù)測(cè)以上所得到的4種蛋白潛在的抗原決定簇，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Hsp90(圖5左上)，Histone 4(圖5右上)，HP(圖5左下)和Ribosomal protein(圖5右下)均存在有許多連續(xù)的峰值，這些峰值指代潛在的抗原表位，Hsp90存在24個(gè)潛在的抗原表位；Histone 4存在4個(gè)潛在的抗原表位；HP存在5個(gè)潛在的抗原表位；Ribosomal protein存在5個(gè)潛在的抗原表位。

利用Phyre2在線軟件(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/)對(duì)以上所得4種蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，蛋白三維結(jié)構(gòu)模型如圖6所示。經(jīng)在線軟件分析4種蛋白三維結(jié)構(gòu)模型的可信度分別是100%、100%、99.9%和99.9%，說(shuō)明4種蛋白模型具有很高的可信度。

圖5 外分泌性蛋白的抗原表位分析

圖6 外分泌性蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

3 討論

因生物信息學(xué)與傳統(tǒng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法相比，具有高效和低成本的特點(diǎn)[7]，故如今用生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)未知蛋白的生物學(xué)功能、結(jié)構(gòu)和其他生物特性的研究越來(lái)越多。雞球蟲(chóng)病是我國(guó)嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的常見(jiàn)疾病之一，每年都會(huì)造成養(yǎng)雞業(yè)的巨大的經(jīng)濟(jì)損失，所以對(duì)雞球蟲(chóng)病的防治不可輕視。

E.tenella入侵宿主細(xì)胞的過(guò)程需要通過(guò)粘附、侵入、形成納蟲(chóng)空泡后寄生于宿主細(xì)胞內(nèi)，而在它的寄生過(guò)程之中，行使主要入侵作用的蛋白分子可能就是我們免疫預(yù)防研究中的主要球蟲(chóng)疫苗抗原。故本試驗(yàn)通過(guò)用Transwell小室將E.tenella第二代裂殖子和MDBK細(xì)胞隔離共培養(yǎng)12 h后，收集蛋白培養(yǎng)液上清，以此來(lái)獲得主要的外分泌蛋白分子，通過(guò)一系列生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)這些蛋白作為球蟲(chóng)疫苗候選抗原的可能性。

本試驗(yàn)通過(guò)生物信息學(xué)分別分析4種蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、跨膜結(jié)構(gòu)域、親疏水性、信號(hào)肽、抗原表位以及三維結(jié)構(gòu)，在利用SOPMA分析二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)，Hsp90、Histone 4、HP和Ribosomal protein的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是由α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲以及β-轉(zhuǎn)角所構(gòu)成的，且均沒(méi)有β-折疊，在蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋和β-折疊的結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，而無(wú)規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角的結(jié)構(gòu)較為松散又不穩(wěn)定，就能更好的與抗體結(jié)合，參與免疫反應(yīng)[8]，以上結(jié)構(gòu)分析結(jié)果說(shuō)明4種蛋白均有作為抗原的結(jié)構(gòu)潛力。在利用TMHMM做跨膜結(jié)構(gòu)域分析時(shí)，橫坐標(biāo)指的是序列位置，縱坐標(biāo)指的是幾率[9]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種蛋白的膜內(nèi)區(qū)域幾率均極低，而膜外區(qū)域幾率都很高，說(shuō)明這4種蛋白均無(wú)跨膜區(qū)。蛋白質(zhì)的親疏水性是構(gòu)成蛋白質(zhì)折疊的主要驅(qū)動(dòng)力。蛋白質(zhì)折疊時(shí)會(huì)形成疏水內(nèi)核和親水表面，同時(shí)有潛在跨膜區(qū)出現(xiàn)高疏水值區(qū)域，據(jù)此可以測(cè)定跨膜螺旋等二級(jí)結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)表面氨基酸分布[10]。在利用Protscale做親疏水性的分析中，認(rèn)為位于1.0～3.0表示高疏水性氨基酸，反之位于-1.0～-3.0的區(qū)域即親水性較強(qiáng)的區(qū)域，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種蛋白多肽鏈均具有極強(qiáng)的疏水性。在利用SignalP做信號(hào)肽分析時(shí)，C值最高峰值是指該位點(diǎn)很可能是剪切位點(diǎn)，Y值最高峰值是指最佳的剪切位點(diǎn)，S值則用來(lái)區(qū)分該位點(diǎn)是否為信號(hào)肽部位，D值是S-mean和Y-max的加權(quán)平均值，可以用來(lái)區(qū)分分泌及非分泌蛋白，分泌性蛋白計(jì)算值高，反之則低[11]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Hsp90和Histone 4存在信號(hào)肽，分別在16～17和17～18氨基酸之間可能存在最佳剪切位點(diǎn)，而HP和Ribosomal protein則不存在信號(hào)肽。在利用Immunomedicine Group做抗原表位分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，4種蛋白均存在抗原表位，Hsp90存在24個(gè)潛在的抗原表位，Histone 4存在4個(gè)潛在的抗原表位，HP存在5個(gè)潛在的抗原表位，Ribosomal protein存在5個(gè)潛在的抗原表位，抗原表位的存在說(shuō)明4種蛋白作為抗原均能夠引起良好的免疫反應(yīng)，故這些蛋白有可能成為柔嫩艾美耳球蟲(chóng)最為重要的潛在藥物靶點(diǎn)或疫苗候選抗原。最后對(duì)4種蛋白三維結(jié)構(gòu)建模，結(jié)果顯示，Hsp90、Histone 4、HP和Ribosomal protein主要是由α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲以及β-轉(zhuǎn)角組成，與各蛋白相應(yīng)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果相一致，且可信度高，基本能夠反映4種蛋白的空間構(gòu)象。這4種蛋白三維結(jié)構(gòu)模型的構(gòu)建有利于可視化分析，也為今后研究其構(gòu)效關(guān)系提供了理論基礎(chǔ)。

通過(guò)間接共培養(yǎng)獲得的這4種蛋白，Hsp90是具有高度保守性的蛋白質(zhì)，在基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞生長(zhǎng)、分化等方面均發(fā)揮著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，雞堆型艾美耳球蟲(chóng)Hsp90能夠提高雞的免疫應(yīng)答，包括體液免疫和細(xì)胞免疫[12]。Histone 4是真核生物染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)蛋白，當(dāng)細(xì)胞壞死時(shí)會(huì)被釋放到細(xì)胞外發(fā)揮炎癥作用[13]。Histone 4是真核生物染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)蛋白，當(dāng)細(xì)胞壞死時(shí)會(huì)被釋放到細(xì)胞外發(fā)揮炎癥作用。在其他頂復(fù)門原蟲(chóng)，如發(fā)現(xiàn)Histone能夠與外周網(wǎng)狀物質(zhì)結(jié)合將利什曼原蟲(chóng)在細(xì)胞外殺死[14]，說(shuō)明它具有殺死細(xì)胞外細(xì)菌或外來(lái)物質(zhì)的作用。Ribosomal protein是參與生物系統(tǒng)發(fā)育與分化的重要蛋白。在利什曼原蟲(chóng)發(fā)現(xiàn)能保護(hù)機(jī)體引起T細(xì)胞的分泌[15]；在日本血吸蟲(chóng)被發(fā)現(xiàn)具有免疫保護(hù)效果[16]。這些研究表明，這3種蛋白都被發(fā)現(xiàn)能夠作為抗原引起機(jī)體的免疫應(yīng)答。而HP的功能至今雖還不清楚，但通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)HP不存在信號(hào)肽，存在抗原表位，且具有易于發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的結(jié)構(gòu)。

總的來(lái)說(shuō)，結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)4種蛋白均無(wú)跨膜區(qū)，主要由α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲以及β-轉(zhuǎn)角組成，這種結(jié)構(gòu)導(dǎo)致蛋白不穩(wěn)定，易發(fā)生免疫反應(yīng)?？乖砦环治霭l(fā)現(xiàn)4種蛋白均存在抗原表位，這說(shuō)明它們均能夠引起良好的免疫反應(yīng)。且其他頂復(fù)門原蟲(chóng)的Hsp90、Histone 4和Ribosomal protein均被研究出具有免疫原性。綜上推測(cè)這4種蛋白有望成為重要的潛在藥物靶點(diǎn)或疫苗候選抗原。

在獲得的4種蛋白中，HP蛋白因具有以下幾個(gè)特點(diǎn)被認(rèn)為具有作為疫苗候選抗原的可能性，首先HP蛋白還未被研究過(guò)；其次HP蛋白無(wú)信號(hào)肽，目的蛋白就不會(huì)進(jìn)行定位，同樣，目的蛋白就不會(huì)有信號(hào)肽被細(xì)胞識(shí)別切除，從而使得外源表達(dá)目的蛋白能夠正確折疊以及提高了外源表達(dá)蛋白時(shí)的分泌性效率[17-18]，故接下來(lái)會(huì)通過(guò)外源表達(dá)對(duì)HP蛋白進(jìn)行研究，預(yù)測(cè)其成為新型疫苗的候選抗原的可能。