陳建歐 王瑩瓊 李麗燕 鄭旭旭

p,p′-DDT是有機(jī)氯農(nóng)藥滴滴涕（dichlorodiphenytrichloroethane，DDT）的主要成分，曾廣泛用于農(nóng)業(yè)殺蟲和治療瘧疾等傳染病[1]。因DDT對環(huán)境和動物危害嚴(yán)重，現(xiàn)已被禁止使用。有研究表明我國食品中仍能檢測到殘留的DDT，含量遠(yuǎn)超過發(fā)達(dá)國家平均值[2]。殘余DDT可通過食物鏈和生物富集作用逐級放大到較高濃度，長期蓄積于人體內(nèi)可嚴(yán)重危害人類生命健康[3]。乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，流行病學(xué)調(diào)查顯示影響乳腺癌發(fā)生的因素中73%歸因于環(huán)境，DDT可增加乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險。Cohn等[4]研究發(fā)現(xiàn)，母親接觸過高劑量p,p′-DDT的女性患乳腺癌的風(fēng)險比低劑量對照組提高3.7倍。胡大為等[5]證實(shí)p,p′-DDT是影響乳腺癌發(fā)生的高風(fēng)險因素，人體內(nèi)殘余p,p′-DDT呈明顯劑量-反應(yīng)關(guān)系，其負(fù)載量與乳腺癌的發(fā)生呈正相關(guān)。然而，目前p,p′-DDT暴露與乳腺癌發(fā)病的關(guān)系尚不清楚。造成乳腺癌高復(fù)發(fā)率和病死率的主要原因是癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，細(xì)胞黏附（包括細(xì)胞間黏附和細(xì)胞與基質(zhì)間黏附）在此過程中發(fā)揮了重要作用。鈣黏附蛋白E（E-cadherin）是一種鈣依賴型細(xì)胞黏附分子，介導(dǎo)同型細(xì)胞間連接，在腫瘤早期浸潤中起調(diào)控作用[6-7]。整合素是一組細(xì)胞表面跨膜受體，識別細(xì)胞與胞外基質(zhì)組分。CD29為整合素βl鏈，是介導(dǎo)細(xì)胞與胞外基質(zhì)黏附的關(guān)鍵因子[8-10]。本研究旨在探討p,p′-DDT暴露對乳腺癌細(xì)胞MCF-7黏附能力及細(xì)胞黏附分子E-cadherin和CD29的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器 p,p′-DDT干粉試劑購自中國Sigma公司，結(jié)晶紫染色液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，All-in-OneTMFirst-Strand cDNA SynthesisKit User Manual試劑盒、PrimeScript All-in-One-qPCRMix試劑盒、抗E-cadherin抗體、抗α-tubulin抗體、抗CD29抗體購自廣州復(fù)能基因有限公司，二抗羊抗鼠IgG（H+L）、羊抗兔 IgG（H+L）購自美國英杰生命技術(shù)有限公司，常規(guī)試劑由本實(shí)驗室提供。倒置顯微鏡購自日本尼康公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7購自上海美軒生物有限公司。將MCF-7置于含10%FBS、1%雙抗的完全培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗。

1.3 p,p′-DDT最適刺激濃度、時間條件的確定 將p,p′-DDT溶于DMSO配成100mmol/L儲備液。使用時用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋至室驗所需濃度。用不同濃度 p,p′-DDT（0、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L）分別處理MCF-7 24和48h，選出促進(jìn)MCF-7遷移作用最明顯的適宜p,p′-DDT的濃度和時間，以此作為最佳條件來進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。

1.4 細(xì)胞間黏附率測定 采用細(xì)胞聚集試驗。取對數(shù)生長期狀態(tài)良好的MCF-7，分為對照組和試驗組，對照組使用完全培養(yǎng)基，試驗組培養(yǎng)基中加入終濃度為10-7mol/L的p,p′-DDT。培養(yǎng)48h后接種于96孔板，37℃、80r/min搖床振蕩1h，統(tǒng)計細(xì)胞間成團(tuán)數(shù)N。試驗組相對于對照組的細(xì)胞間黏附率=N試驗組/N對照組×100%。實(shí)驗重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞與基質(zhì)間黏附率測定 采用結(jié)晶紫染色法。取對數(shù)生長期狀態(tài)良好的MCF-7，分為對照組和試驗組，對照組使用完全培養(yǎng)基，試驗組培養(yǎng)基中加入終濃度為10-7mol/L的p,p′-DDT。培養(yǎng)48h后接種于 96孔板，于接種后0.5、1、1.5和2h再用50μl甲醇固定 20min，50μl 0.5%結(jié)晶紫染色 20min，50μl 1%SDS溶解，室溫孵育10min，測定波長570nm處的吸光度值（A570）。試驗組相對于對照組的細(xì)胞與基質(zhì)間黏附率=（試驗組A570/對照組A570）×100%。實(shí)驗重復(fù)3次。

1.6 MCF-7中E-cadherin和CD29 mRNA表達(dá)水平檢測 采用RT-qPCR法。取對數(shù)生長期狀態(tài)良好的MCF-7接種于60mm培養(yǎng)皿中，試驗組培養(yǎng)基中加入終濃度為10-7mol/L的p,p′-DDT。培養(yǎng)48h后提取細(xì)胞總RNA，再反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。以GAPDH為內(nèi)參。PCR反應(yīng)體系如下：cDNA 4μl，上游和下游引物 1μl，PrimeScript Mix 12.5μl，純凈水 6.5μl。反應(yīng)所用引物如下：GAPDH 上游引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物：5′-GGTGAAGACGCCAGTGGA-3′；E-cadherin 上游引物：5′-AGGACCAGGTGACCACCCTAGA-3′，下游引物：5′-TGCCCAAGATGGCAGGAAC-3′；CD29 上游引物：5′-AATGAAGGGCGTGTTGGTAG-3′，下游引物：5′-CTGCCAGTGTAGTTGGGGTT-3′。

1.7 MCF-7中E-cadherin和CD29蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot法。取對數(shù)生長期狀態(tài)良好的MCF-7接種于60mm培養(yǎng)皿中，試驗組培養(yǎng)基中加入終濃度為10-7mol/L的p,p′-DDT。培養(yǎng)48h后提取細(xì)胞總蛋白，BCA法定量后蛋白變性于10%SDS-PAGE凝膠電泳，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉1.5h，抗E-cadherin 抗體（1∶1 000）、抗 CD29 抗體（1∶1 000）和抗 α-tubulin抗體（1∶1 000）4℃孵育過夜，洗膜后 HRP標(biāo)記二抗（1∶1 000）室溫孵育 1h，HRP-ECL 顯影曝光。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p,p′-DDT最適刺激濃度、時間條件確定及其對MCF-7細(xì)胞間黏附率的影響 10-7mol/L的p,p′-DDT作用MCF-7 48h后，細(xì)胞遷移作用最明顯，MCF-7細(xì)胞間黏附能力明顯降低。與對照組相比，試驗組細(xì)胞間黏附能力降低，試驗組相對于對照組的細(xì)胞間黏附率為（59.7±8.15）%，見圖 1。

圖1 p,p′-DDT對MCF-7細(xì)胞間黏附率的影響（a：對照組細(xì)胞；b：試驗組細(xì)胞；倒置顯微鏡下，×200）

2.2 p,p′-DDT對MCF-7細(xì)胞與基質(zhì)間黏附率的影響與對照組相比，0.5、1、1.5和2h時試驗組細(xì)胞與基質(zhì)間的黏附能力均增強(qiáng)。0.5、1、1.5和2h時試驗組相對于對照組的細(xì)胞與基質(zhì)間黏附率分別為（212.8±0.20）%、（153.9±0.42）%、（174.5±0.18）%和（131.5±0.43）%，見圖 2。

圖2 p,p′-DDT對MCF-7細(xì)胞與基質(zhì)間黏附率的影響（a：0.5h對照組細(xì)胞；b：0.5h試驗組細(xì)胞；c：1h對照組細(xì)胞；d：1h試驗組細(xì)胞；e：1.5h 對照組細(xì)胞；f：1.5h 試驗組細(xì)胞；g：2h 對照組細(xì)胞；h：2h 試驗組細(xì)胞；倒置顯微鏡下，×200）

2.3 p,p′-DDT對 MCF-7中E-cadherin表達(dá)的影響10-7mol/L的p,p′-DDT作用MCF-7 48h后，試驗組E-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)水平均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表1和圖3。

表1 p,p′-DDT對MCF-7中E-cadherin表達(dá)的影響

圖3 p,p′-DDT對MCF-7中E-cadherin蛋白表達(dá)的電泳圖

2.4 p,p′-DDT對 MCF-7中 CD29表達(dá)的影響 經(jīng)10-7mol/L的p,p′-DDT作用MCF-7 48h后，試驗組CD29 mRNA和蛋白表達(dá)水平均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表2和圖4。

3 討論

以往研究證明，有機(jī)污染物p,p′-DDT具有一定的致癌性，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[11]。趙君宇等[12]研究認(rèn)為p,p′-DDT可能通過影響癌細(xì)胞的黏附能力促進(jìn)其侵襲轉(zhuǎn)移，最終導(dǎo)致細(xì)胞游離出基底膜，這一過程是腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的第一步。本研究發(fā)現(xiàn)p,p′-DDT能明顯減少M(fèi)CF-7細(xì)胞間黏附率但同時增加細(xì)胞與基質(zhì)間黏附率。此過程可能是p,p′-DDT促使乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制之一。

表2 p,p′-DDT對MCF-7中CD29表達(dá)的影響

圖4 p,p′-DDT對MCF-7中CD29蛋白表達(dá)的電泳圖

細(xì)胞黏附分子是一類分布于細(xì)胞膜表面，介導(dǎo)同型細(xì)胞間及細(xì)胞與基質(zhì)間黏附的分子，其改變與腫瘤細(xì)胞黏附能力的改變密切相關(guān)。Liu等[13]報道當(dāng)黏附分子E-cadherin功能缺失后，會造成細(xì)胞間黏附能力喪失，導(dǎo)致腫瘤容易發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移。E-cadherin可抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，在發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的癌細(xì)胞系里E-cadherin呈現(xiàn)低表達(dá)[14]。而CD29能通過提高細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移[10，15]。

本文研究了p,p′-DDT暴露后 MCF－7中E-cad－h(huán)erin和CD29的表達(dá)水平。結(jié)果表明，經(jīng)10-7mol/L p,p′-DDT處理后，MCF-7中 E-cadherin的 mRNA和蛋白表達(dá)水平均呈明顯下降趨勢，細(xì)胞聚集試驗分析則顯示p,p′-DDT暴露降低了MCF-7細(xì)胞間黏附能力。由此說明p,p′-DDT可能通過下調(diào)細(xì)胞間黏附分子E-cadherin的表達(dá)水平來抑制MCF-7細(xì)胞間的黏附。而MCF-7中CD29的mRNA和蛋白表達(dá)水平均呈明顯上升趨勢，結(jié)晶紫染色法分析則顯示p,p′-DDT暴露升高了MCF-7細(xì)胞與基質(zhì)間的黏附能力。本研究表明p,p′-DDT可能通過上調(diào)細(xì)胞與基質(zhì)間黏附分子CD29的表達(dá)水平來促進(jìn)MCF-7細(xì)胞與基質(zhì)間的黏附。目前的研究僅從p,p′-DDT對MCF-7黏附能力的影響及機(jī)制探討其對乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的影響。p,p′-DDT還可能通過影響乳腺癌的細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種因素促進(jìn)乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，還需對此方面進(jìn)行深層次的研究。

綜上所述，p,p′-DDT對MCF-7的細(xì)胞黏附能力及細(xì)胞黏附分子E-cadherin和CD29的表達(dá)有較大影響。10-7mol/L的p,p′-DDT能明顯降低MCF-7同型細(xì)胞間的黏附，同時增強(qiáng)細(xì)胞與基質(zhì)間的黏附。p,p′-DDT可能是通過下調(diào)E-cadherin并上調(diào)CD29的表達(dá)水平，從而改變細(xì)胞黏附能力來促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。