余 鑫,米智華,高 巨

(揚州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 江蘇省蘇北人民醫(yī)院 麻醉科,江蘇 揚州,225001)

機械通氣是治療全身麻醉和急危重患者的重要輔助措施，臨床上全麻下高危手術(shù)后需要長時間機械通氣的患者數(shù)量日益增加[1]。然而，有研究[2-3]表明，長時間機械通氣可導(dǎo)致呼吸機相關(guān)性肺損傷(VILI)，甚至導(dǎo)致其他遠隔器官的損傷，如急性腦功能障礙[4]，其機制可能與誘發(fā)腦組織炎癥及神經(jīng)元凋亡有關(guān)[5-6]。自噬廣泛存在于真核細胞中，它既是細胞的一種自我保護機制，同時也被認為是一種與凋亡、壞死并列的細胞程序性死亡機制[7-8]。研究[9]表明，自噬相關(guān)蛋白參與了大鼠呼吸機相關(guān)性肺損傷過程，但自噬對機械通氣致大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡的作用尚不清楚。本研究擬建立大鼠機械通氣致神經(jīng)元凋亡模型，探討自噬在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康成年雄性Wister大鼠24只，體質(zhì)量200～250 g,由揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供。采用隨機數(shù)字表法將其分為4組:對照組(C組)、機械通氣組(MV組)、機械通氣+6-氨基-3-甲基嘌呤處理組(3MA組)、機械通氣+雷帕霉素處理組(R組)，每組6只。

1.2 方法

實驗前禁食10 h,自由飲水。腹腔注射0.7%水合氯醛5 mL/kg麻醉大鼠。參照文獻[10]的方法制備機械通氣致大鼠腦損傷模型。左側(cè)頸內(nèi)靜脈穿刺置管用于泵注維庫溴銨維持肌松。頸部正中備皮、消毒，在距胸骨約1 cm處縱行剪開皮膚，鈍性分離皮下組織與肌肉，暴露氣管，切開并插管，固定。C組保留自主呼吸，不行機械通氣。MV組、3MA組及R組接DW 3000型小動物呼吸機(安徽省淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)行機械通氣。呼氣末正壓(PEEP)為0時吸入空氣。呼吸參數(shù)設(shè)置:吸呼比1∶2、潮氣量40 mL/kg、通氣頻率40次/min、通氣時間6 h。3MA組及R組于MV前15 min分別腹腔注射自噬抑制劑3-MA 30 mg/kg及自噬激活劑雷帕霉素1 mg/kg,C組于MV前15 min腹腔注射等量生理鹽水。

機械通氣結(jié)束后立即于深麻醉下斷頭取腦，冰上快速分離海馬，取部分海馬組織,4%多聚甲醛固定后進行石蠟包埋，制備病理切片，常規(guī)蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元病理學(xué)改變。采用TUNEL染色法定量檢測凋亡細胞。石蠟切片脫蠟至水，加入濃度為20 pg/mL的蛋白酶K溶液消化，孵育15 min,PBS沖洗2 min(3次)，擦干組織周圍水分。加入TUNEL反應(yīng)液混合液覆蓋樣本區(qū)，于濕盒中37 ℃反應(yīng)1 h。PBS漂洗3 min(3次)，滴加POD,至濕盒內(nèi)37℃孵育30 min,PBS沖洗5 min(3次)，滴加DAB溶液顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。凋亡神經(jīng)元細胞核為深淺不一的棕黃色或棕褐色，非凋亡神經(jīng)元細胞核呈藍色。200倍光學(xué)顯微鏡下觀察神經(jīng)元形態(tài);隨機選取每張切片的5個視野，計算細胞凋亡指數(shù)(AI)=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

取上述大鼠海馬組織,-80 ℃冰箱凍存。檢測時取海馬組織，加入蛋白裂解液，勻漿后4 ℃、12 000轉(zhuǎn)/min下離心15min,取上清液使用BCA法進行蛋白測定。取50 μg總蛋白上樣,SDS-PAGE電泳，電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,洗膜緩沖液(TBST)洗膜10 min,重復(fù)3次。加入一抗(抗Caspase-3、Bax/Bcl-2、Beclin-1、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、p62抗體),4 ℃孵育過夜。TBST洗膜10 min,重復(fù)3次;加入二抗(辣根過氧化物酶標記山羊抗兔)后室溫孵育1 h,TBST清洗，最后加入顯色底物顯色曝光，采用Image J圖像分析軟件測定各蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠腦組織病理學(xué)改變

C組海馬組織未見明顯的病理學(xué)改變，神經(jīng)元排列緊密有序，神經(jīng)元數(shù)量較多，胞體大小正常，形態(tài)規(guī)則，胞核呈圓形或橢圓形，核仁明顯，染色質(zhì)均勻;MV組神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)明顯異常，層次紊亂，神經(jīng)元數(shù)量減少、排列稀疏、間隙增大，胞核深染、固縮;與MV組相比,3MA組病理學(xué)損傷明顯減輕，正常神經(jīng)元數(shù)量較多，神經(jīng)元排列比較緊密，胞核呈圓形或橢圓形，核仁清晰，少見固縮變性的神經(jīng)元;與MV組相比，R組病理學(xué)損傷進一步加重。見圖1。

a. C組

b. MV組

c. 3MA組

d. R組

圖1光鏡下觀察各組大鼠腦組織病理學(xué)改變

2.2 神經(jīng)元凋亡指數(shù)、Bax/Bcl-2比值、活化型Caspase-3表達比較

與C組比較，其余3組組海馬神經(jīng)元凋亡指數(shù)和Bax/Bcl-2比值升高，海馬活化型Caspase-3表達顯著上調(diào)(P<0.05);與MV組比較,3MA組大鼠的海馬神經(jīng)元凋亡指數(shù)和Bax/Bcl-2比值下降，海馬活化型Caspase-3表達顯著下調(diào)(P<0.05);與MV組比較,R組大鼠的海馬神經(jīng)元凋亡指數(shù)和Bax/Bcl-2比值升高，海馬活化型Caspase-3表達顯著上調(diào)(P<0.05)。見表1。

表1 4組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡指數(shù)、Bax/Bcl-2比值、活化型Caspase-3表達比較

與C組比較,*P<0.05;與MV組比較,#P<0.05。

2.3 Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ比值、p62表達比較

與C組比較，其余3組海馬Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ表達上調(diào),p62表達顯著下調(diào)(P<0.05);與MV組比較,3MA組大鼠海馬Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ表達下調(diào),p62表達顯著上調(diào)(P<0.05);與MV組比較,R組大鼠海馬Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ表達上調(diào),p62表達顯著下調(diào)(P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠海馬Beclin-1、LC3Ⅱ/I比值、p62表達比較

與C組比較,*P<0.05;與MV組比較,#P<0.05。

3 討 論

機械通氣是治療危重患者和全麻患者的重要手段之一，但長時間機械通氣也可能會導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)損傷，引起認知功能及記憶力的下降[11]。自噬是廣泛存在的細胞維持穩(wěn)態(tài)的生理現(xiàn)象，適當激活的自噬可以阻礙疾病發(fā)展，但是過度激活的自噬也可能加重細胞損傷。因此，探討自噬在機械通氣致大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡中的作用具有重要意義。

本研究大鼠均采用水合氯醛麻醉，均衡了麻醉因素對海馬神經(jīng)元凋亡的影響。參照文獻[10],采用大潮氣量長時間機械通氣法建立機械通氣致腦損傷模型。因為海馬是腦區(qū)中與記憶和學(xué)習(xí)練習(xí)最為密切，所以本研究采集大鼠海馬作為取材部位[12]。本研究結(jié)果顯示,6 h、40 mL/kg機械通氣下大鼠海馬組織出現(xiàn)明顯病理學(xué)改變，海馬神經(jīng)元凋亡指數(shù)升高，提示本研究機械通氣致大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡模型制備成功。

Caspase是一個在細胞凋亡過程中起重要作用的蛋白酶家族,Caspase-9在凋亡起始中具有重要作用，激活的Caspase-9可以激活細胞凋亡的最關(guān)鍵酶Caspase-3,從而促進后續(xù)的細胞凋亡信號[13]。Bcl-2是凋亡抑制因子,Bax是凋亡促進因子，常用Bax/Bcl-2的比值反映細胞凋亡情況[14-15]。本研究表明，與MV組相比,3MA組Bax/Bcl-2比值下降、海馬活化型Caspase-3表達下調(diào),R組Bax/Bcl-2比值升高，海馬活化型Caspase-3表達上調(diào)，提示自噬抑制劑3-MA減輕了機械通氣導(dǎo)致的腦組織神經(jīng)元凋亡程度，自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素加重了機械通氣致腦組織神經(jīng)元凋亡程度。

Beclin-1是哺乳動物參與自噬泡形成的特異性基因，是自噬起始的重要調(diào)節(jié)因子,Beclin-1的表達水平可以反映自噬程度[16]。LC3是哺乳動物細胞中酵母ATG8基因的同源物，分為LC3Ⅰ型和LCⅡ型，自噬發(fā)生時LC3 Ⅰ經(jīng)泛素樣加工修飾與磷脂酰乙醇胺結(jié)合，形成LC3 Ⅱ,LC3Ⅱ與LC3Ⅰ的比值常用來反映自噬水平[17]。p62是機體內(nèi)蛋白降解途徑的關(guān)鍵蛋白分子，其表達水平與自噬水平呈反比[18]。本研究結(jié)果表明，與C組比較,MV組海馬Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ表達上調(diào)，p62表達下調(diào)。與MV組比較,3MA組大鼠海馬Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ表達下調(diào)，p62表達上調(diào),R組與之相反，提示機械通氣致大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡的機制與自噬有關(guān)。

綜上所述，長時間大潮氣量機械通氣致大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡的機制與自噬有關(guān)，但其具體機制仍有待進一步研究。