何光華 李歸浦 周 兵 肖海龍 儲(chǔ)小軍 葉興乾

（1 浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院 杭州310058 2 貝因美嬰童食品股份有限公司 杭州310053 3 貝因美（杭州）食品研究院有限公司 杭州311106 4 杭州市食品藥品檢驗(yàn)研究院 杭州310022）

母乳是嬰兒的最佳主食，它富含多種人體必需脂肪酸、優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、低聚糖和免疫物質(zhì)等，與牛乳、羊乳等相比，不但營(yíng)養(yǎng)均衡，而且更有利于嬰兒的消化、吸收和利用，然而很大一部分嬰兒由于某些特殊原因無(wú)法進(jìn)行正常的母乳喂養(yǎng)，這時(shí)作為母乳替代品的嬰兒配方乳粉就成為一種比較理想的選擇。對(duì)于嬰兒配方乳粉而言，母乳是黃金標(biāo)準(zhǔn)，母乳化是終極目標(biāo)，故首要的工作是母乳研究。脂肪作為母乳的重要組成部分，一直以來(lái)都是母乳研究的熱點(diǎn)之一。早在20 世紀(jì)60年代，國(guó)外就開(kāi)始著手對(duì)母乳脂肪的研究，到目前為止，不僅廣泛而深入地研究了不同地區(qū)、 不同泌乳期母乳的總脂肪酸組成[1-4]，而且還于近年來(lái)重點(diǎn)研究了母乳脂肪的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，包括甘油三酯和磷脂結(jié)構(gòu)的脂肪酸組成及位置分布[5-6]，為嬰兒配方乳粉的脂質(zhì)母乳化研究奠定了基礎(chǔ)。與國(guó)外相比，國(guó)內(nèi)對(duì)母乳脂肪的研究起步較晚 （始于20 世紀(jì)90年代），雖然也有一些報(bào)道[7-10]，但這些研究均只注重對(duì)母乳總脂肪酸組成的分析，而很少涉及對(duì)母乳脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的分析，嚴(yán)重影響了我國(guó)嬰兒配方乳粉的脂質(zhì)母乳化，特別是脂質(zhì)結(jié)構(gòu)母乳化的研究進(jìn)程。

本文以我國(guó)滬浙地區(qū)乳母為對(duì)象，比較研究了不同泌乳期（0～1，1～3，3～6，6～12月）母乳的總脂肪酸、甘油三酯sn-2 位脂肪酸和磷脂脂肪酸組成，并著重對(duì)脂肪酸在母乳甘油三酯結(jié)構(gòu)上的位置分布特點(diǎn)進(jìn)行分析，為我國(guó)嬰兒配方乳粉的脂質(zhì)母乳化研究提供了重要的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

母乳：取自滬浙地區(qū)不同泌乳期乳母。

試劑：甲醇、正己烷、甲酸、氯仿等色譜純?cè)噭掖?、乙醚、石油醚、丙酮、氨水、三氟化?乙醚溶液等分析純?cè)噭?7 種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Nu-Chek 公司；胰蛋白酶，美國(guó)Sigma-Aldrich 公司。

1.2 試驗(yàn)儀器

7890A 型氣相色譜儀 （帶FID 檢測(cè)器和Supeclo 2560 型色譜柱），美國(guó)Agilent 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 母乳樣本采集 采集對(duì)象：母乳樣本采集對(duì)象為上海和浙江地區(qū)0～1，1～3，3～6，6～12月泌乳期乳母，根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）健康、足月、初產(chǎn)、單胎；（2）采用母乳喂養(yǎng)；（3）無(wú)抽煙、飲酒等不良生活習(xí)慣；（4）無(wú)貧血等嚴(yán)重營(yíng)養(yǎng)性疾病及惡性消耗性疾??；（5）無(wú)糖尿病、高血壓等慢性疾?。唬?）近期無(wú)服用營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑等；共征集乳母230 例，其中0～1月泌乳期乳母45 例，1～3月75 例，3～6月64例，6～12月46 例。

采集方法：所有母乳樣本均采用自動(dòng)吸乳器單側(cè)乳房收集，收集時(shí)間為早上9：00～12：00，收集量為20 mL 以上。收集到的母乳樣本立即分裝到5 個(gè)5 mL 凍存管中，然后放至-80 ℃低溫冰箱中以備脂肪酸檢測(cè)分析。

1.3.2 母乳脂肪酸檢測(cè)分析 母乳脂肪提?。翰捎冒彼?乙醇提取法，具體步驟見(jiàn)GB5413.27-2010 第二法脂肪提取部分。

母乳甘油三酯sn-2 位脂肪酸制備：稱取母乳脂肪20 mg 于10 mL 試管中，加入2 mL 1 mol/L Tris-HCL 緩沖液，0.2 mL 2.2%氯化鈣水溶液，0.5 mL 1 g/L 膽酸鈉水溶液，混合均勻，在40 ℃下水浴1 min，再加入胰脂肪酶20 mg，混勻后繼續(xù)水浴3 min，冷卻并添加6 mol/L HCL 溶液1 mL 和2 mL 乙醚，混勻，4 000 r/min 離心5 min，取1 mL 上清液45 ℃下氮?dú)獯蹈?，加? mL 正己烷溶解，得酶解產(chǎn)物。依次用5 mL 丙酮和正己烷活化氨基柱（500 mg/6 mL），將酶解產(chǎn)物上樣，用丙酮∶正己烷=15 ∶85（體積比）5 mL 淋洗，丙酮：正己烷=50 ∶50（體積比）5 mL 洗脫，收集洗脫液，45 ℃下氮?dú)獯蹈?，得甘油三酯sn-2 位脂肪酸備用。

母乳磷脂脂肪酸制備：稱取母乳脂肪100 mg，加入100 μL 氯仿/甲醇溶液溶解，點(diǎn)樣于薄層板，并在展開(kāi)缸中采用脂類展開(kāi)劑：石油醚/乙醚/甲酸=85 ∶15 ∶2（體積比）展開(kāi)。展開(kāi)后風(fēng)干，刮下磷脂層于試管中，加入5 mL 氯仿/甲醇溶液溶解，渦 旋2 min，超 聲5 min 后，2 100 r/min 離 心5 min。取上清液45 ℃下氮?dú)獯蹈?，得磷脂脂肪酸備用?/p>

母乳脂肪酸甲酯化：分別取制備得到的母乳總脂肪酸、 甘油三酯sn-2 位脂肪酸和磷脂脂肪酸，加入0.7 mL 1 mol/L 的氫氧化鉀/甲醇溶液，混勻，置于60 ℃水浴中振蕩3 min，待冷卻至室溫，加入1 mL 14%的三氟化硼/乙醚溶液，混勻，置于50 ℃烘箱中反應(yīng)15 min，待冷卻至室溫，加入2 mL 飽和NaCl 溶液和1 mL 正己烷，混勻，4 000 r/min 離心5 min，取上清液進(jìn)氣相色譜檢測(cè)。

母乳脂肪酸氣相色譜檢測(cè)：脂肪酸的分離檢測(cè)采用氣相色譜法，檢測(cè)條件為色譜柱：Supeclo 2560（100 m×0.25 mm×0.20 μm），進(jìn)樣口溫度：240℃，分流比：10 ∶1，進(jìn)樣量：1 μL，程序升溫：初始溫度60 ℃（保持2 min），以15 ℃/min 升至100 ℃，再以3 ℃/min 升至230 ℃（保持18 min），載氣（N2）流速：1.0 mL/min；檢測(cè)器溫度：250℃；氫氣流速：40 mL/min；空氣流速：400 mL/min。

母乳脂肪酸定性與定量分析：脂肪酸的定性通過(guò)與脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品的氣相圖譜比較得出，脂肪酸的定量采用面積歸一法得出。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，各組數(shù)據(jù)間的顯著性差異采用單因素方差分析 （ANOVA）方法得出，所用統(tǒng)計(jì)都在SPSS16.0 軟件中實(shí)現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同泌乳期母乳總脂肪酸和甘油三酯sn-2位脂肪酸組成

不同泌乳期母乳總脂肪酸和甘油三酯sn-2位脂肪酸組成分別見(jiàn)表1和2，從表中可以看出，中鏈飽和脂肪酸（MCSFA）、飽和脂肪酸（SFA）、單不飽和脂肪酸（MUFA）和多不飽和脂肪酸（PUFA）在母乳總脂肪酸中的含量分別為7.45%～10.45%、34.42%～36.79%、35.91%～41.22%、23.63%～27.56%，而在母乳甘油三酯sn-2 位脂肪酸中的含量分別為10.13%～14.47%、64.99%～66.10%、22.80%～23.78%、10.19%～10.65%。不管是母乳總脂肪酸還是甘油三酯sn-2 位脂肪酸，C12：0、C14：0和C16：0、C18：0均是最主要的MCSFA 和SFA，C18：1n-9是含量最高的MUFA，而n-6 PUFA 和n-3 PUFA均主要由C18：2n-6（LA）、C20：4n-6（ARA） 和C18：3n-3（ALA）、C22：6n-3（DHA）組成。在母乳總脂肪酸中，n-6/n-3、LA/ALA、ARA/DHA 的比例分別為10.56～15.59、12.71～20.38、1.21～1.63，而在母乳甘油三酯sn-2 位脂肪酸中的比例分別為5.13～9.61、12.02～25.91、1.29～1.44。

就母乳總脂肪酸組成而言，隨著泌乳期的延長(zhǎng)，C12：0、C14：0和MCSFA含量呈逐漸升高的趨勢(shì)，C18：1n-9、MUFA、ARA 和DHA 含量呈先顯著降低而后趨于相對(duì)穩(wěn)定的趨勢(shì)，LA、ALA、PUFA、n-6 PUFA 和n-3 PUFA 含量呈先逐漸升高而后降低的趨勢(shì)，n-6/n-3 和LA/ALA 比例呈先保持穩(wěn)定而后顯著升高的趨勢(shì)，而C16：0、C18：0和SFA 含量以及ARA/DHA 比例在不同泌乳期母乳中均沒(méi)有顯著性差異。就母乳甘油三酯sn-2 位脂肪酸組成而言，隨著泌乳期的延長(zhǎng)，C12：0、C14：0、MCSFA、LA 以及n-6/n-3、LA/ALA 比例呈逐漸升高的趨勢(shì)，ALA、ARA、DHA、n-3 PUFA 含量呈先顯著降低而后趨于相對(duì)穩(wěn)定的趨勢(shì)，而C16：0、C18：0、SFA、C18：1n-9、MUFA、PUFA、n-6 PUFA 含量以及ARA/DHA 比例在不同泌乳期母乳中均沒(méi)有顯著性差異。

表1 不同泌乳期母乳總脂肪酸組成比較（%）Table1 Comparison of fatty acid composition in total lipids of breast milk during different lactation periods （%）

（續(xù)表1）

表2 不同泌乳期母乳甘油三酯sn-2 位脂肪酸組成比較（%）Table2 Comparison of fatty acid composition in triglyceride sn-2 position of breast milk during different lactation periods （%）

（續(xù)表2）

2.2 不同泌乳期母乳脂肪酸在甘油三酯結(jié)構(gòu)中的位置分布

鑒于母乳中98%以上的脂肪是以甘油三酯形式存在[11-12]，因此母乳總脂肪酸組成可以近似作為甘油三酯總脂肪酸組成。本研究基于上述前提，以母乳總脂肪酸和甘油三酯sn-2 位脂肪酸組成為基礎(chǔ)，通過(guò)公式[12]：

得出了不同泌乳期母乳各主要脂肪酸在甘油三酯結(jié)構(gòu)中的位置分布，具體見(jiàn)圖1和圖2。從圖1中可以看出，結(jié)合在母乳甘油三酯sn-2 位上的MCSFA 和SFA 占比分別高達(dá)44.5%～46.2%和59.7%～62.9%，而MUFA 和PUFA 占比卻只有19.2%～21.4%和12.6%～14.9%。具體到幾種最主要的脂肪酸單體（圖2），結(jié)合在母乳甘油三酯sn-2 位 上 的C12：0、C16：0、ARA 和DHA 占 比 分 別 達(dá) 到51.1%～64.9% 、71.3%～75.6% 、51.2%～53.9% 和56.6%～57.7%，而C18：1n-9、LA 和ALA 占比卻只有18.5%～20.5%、10.5%～11.6%、8.1%～15.1%。除了C12：0和ALA 以外，大部分主要脂肪酸包括MCSFA、SFA、MUFA、PUFA、C16：0、C18：1n-9、LA、ARA 和DHA 在母乳甘油三酯結(jié)構(gòu)中的位置分布相對(duì)穩(wěn)定，其結(jié)合在sn-2 位上的占比隨泌乳期的延長(zhǎng)幾乎沒(méi)有變化。

2.3 不同泌乳期母乳磷脂脂肪酸組成

不同泌乳期母乳磷脂脂肪酸組成見(jiàn)表3，從表中可以看出，MCSFA、SFA、MUFA 和PUFA 的含量分別為8.61%～14.61%、78.13%～82.44%、7.09%～9.14%、9.98%～13.45%，n-6/n-3 的比例為4.97～8.60。隨著泌乳期的延長(zhǎng)，C12：0、C14：0、MCSFA、LA、ALA 含量以及n-6/n-3 比例呈逐漸升高的趨勢(shì)，C16：0和SFA 含量呈先穩(wěn)定而后顯著下降的趨勢(shì)，PUFA 和n-6 PUFA 含量呈先穩(wěn)定而后顯著升高的趨勢(shì)，n-3 PUFA、ARA 和DHA 含量呈先顯著降低而后趨于相對(duì)穩(wěn)定的趨勢(shì)，而C18：0、C18：1n-9和MUFA 含量在不同泌乳期母乳中均沒(méi)有顯著性差異。

圖1 不同泌乳期母乳中各類脂肪酸結(jié)合在甘油三酯sn-2 位上的占比Fig.1 The ratios of MCSFA，SFA，MUFA and PUFA esterified in triglyceride sn-2 position of breast milk during different lactation periods

圖2 不同泌乳期母乳中各種主要脂肪酸結(jié)合在甘油三酯sn-2 位上的占比Fig.2 The ratios of C12：0，C16：0，C18：1n-9，LA，ALA，ARA and DHA esterified in triglyceride sn-2 position of breast milk during different lactation periods

表3 不同泌乳期母乳磷脂脂肪酸組成比較（%）Table3 Comparison of fatty acid composition in phospholipids of breast milk during different lactation periods （%）

3 討論

截至目前，盡管國(guó)內(nèi)也有一些針對(duì)不同泌乳期母乳脂肪酸組成的研究報(bào)道，但是這些報(bào)道所涉及的母乳樣本泌乳期大多在6 個(gè)月之內(nèi)[8-10]，難以為不同階段（0～6月和6～12月）嬰兒配方乳粉的脂質(zhì)母乳化研究提供足夠的數(shù)據(jù)支撐。相比之下，本研究所采集的母乳樣本同時(shí)包含了0～1，1～3，3～6，6～12月，4 個(gè)不同的泌乳期，因此更有利于直接指導(dǎo)不同階段嬰兒配方乳粉的脂質(zhì)母乳化研究。

就母乳總脂肪酸組成而言，與歐美國(guó)家相比，本研究母乳中的PUFA、LA、ALA、ARA 和DHA 含量明顯較高，而MCSFA 和SFA 含量相對(duì)較低[2，13-14]；與日本、馬來(lái)西亞等沿海島國(guó)相比，本研究母乳中的ARA 和DHA 含量相對(duì)較低[6，15]。這可能與乳母的飲食習(xí)慣不同相關(guān)，歐美國(guó)家乳母的日常飲食以富含MCSFA 和SFA 的動(dòng)物性食品為主，我國(guó)乳母的脂肪酸攝入主要來(lái)源于烹飪食物用的各種富含LA 和ALA 的植物油，而日本、馬來(lái)西亞等沿海島國(guó)乳母日常飲食中攝入了更多富含ARA 和DHA 的海產(chǎn)品。盡管不同國(guó)家母乳的總脂肪酸組成有所差異，但是大部分主要脂肪酸隨泌乳期延長(zhǎng)的變化趨勢(shì)基本相似：MCSFA、C12：0和C14：0含量逐漸升高，LA、ALA 和PUFA 含量先升高后下降，ARA 和DHA 含量先顯著下降而后趨于穩(wěn)定，而SFA、C16：0和C18：0含量幾乎沒(méi)有變化。這種相似的變化趨勢(shì)主要與乳母以及嬰兒在不同時(shí)期的生理特點(diǎn)和需求相關(guān)[9-10，16]。

除了母乳總脂肪組成以外，母乳脂肪酸在甘油三酯結(jié)構(gòu)上的位置分布也一直是備受科學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)之一。近年來(lái)，國(guó)外學(xué)者對(duì)此進(jìn)行了重點(diǎn)研究，相比之下，國(guó)內(nèi)在這方面的研究很少。本研究顯示，滬浙地區(qū)母乳脂肪中MCSFA、SFA、C12：0、C16：0、ARA 和DHA主要結(jié)合在甘油三酯sn-2 位上，而MUFA、C18：1n-9、PUFA、LA 和ALA 主要分布在甘油三酯sn-1，3 位上，且?guī)缀醪浑S泌乳期的變化而變化，其結(jié)果與國(guó)外母乳基本相似[5，17-18]。母乳這種相對(duì)穩(wěn)定的特殊甘油三酯結(jié)構(gòu)非常有利于嬰兒對(duì)脂肪酸、 礦物質(zhì)以及脂溶性維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[12]。研究表明，甘油三酯進(jìn)入嬰兒體內(nèi)后，首先必須經(jīng)過(guò)體內(nèi)胰脂酶的水解，水解產(chǎn)物分別是sn-2 位單甘酯和sn-1，3 位游離脂肪酸，其中sn-2 位單甘酯容易與膽汁酸形成乳糜微粒而直接被腸黏膜吸收，sn-1，3 位游離脂肪酸中，不飽和脂肪酸也能被機(jī)體吸收，而飽和脂肪酸特別是長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸如C16：0和C18：0，容易與鈣和鎂等礦物質(zhì)形成不溶性的皂化物而無(wú)法被機(jī)體吸收，這不僅會(huì)造成飽和脂脂肪酸和鈣、鎂的流失，同時(shí)還會(huì)使嬰兒產(chǎn)生便秘問(wèn)題[19-20]。另有研究顯示，與脂肪酸隨機(jī)分布的甘油三酯相比，DHA 和ARA 主要結(jié)合在sn-2 位上的特殊甘油三酯更有利于機(jī)體對(duì)DHA 和ARA 的吸收利用[21]。

磷脂作為母乳脂肪中的第二大類脂質(zhì)，雖然只占母乳總脂肪的1.0%～1.5%，但卻是嬰兒生長(zhǎng)發(fā)育所必需的基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。脂肪酸特別是長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸（DHA 和ARA）在母乳磷脂中的含量與嬰兒大腦和視力的快速發(fā)育直接相關(guān)。然而，截至目前，國(guó)外關(guān)于母乳磷脂脂肪酸組成的研究很少，而國(guó)內(nèi)幾乎是空白。本研究顯示，母乳磷脂脂肪酸中的ARA 和DHA 含量分別為0.70%～1.19%、0.82%～1.41%，盡管不同泌乳期之間有所差異，但均顯著高于其在母乳總脂肪酸中的含量（0.54%～0.80%、0.38%～0.62%），結(jié)果與國(guó)外母乳相似[6，14]，這種脂質(zhì)脂肪酸組成模式更有利于促進(jìn)嬰兒大腦和視力的快速發(fā)育。已有研究表明，結(jié)合在磷脂上的DHA 和ARA 比結(jié)合在甘油三酯上的更容易被嬰兒吸收和利用[21]。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)我國(guó)滬浙地區(qū)不同泌乳期母乳總脂肪酸、甘油三酯sn-2 位脂肪酸和磷脂脂肪酸的組成及分布研究，得出：（1）除飽和脂肪酸（不包括中鏈）以外，母乳中大部分主要脂肪酸的含量均隨泌乳期的變化而變化，且變化趨勢(shì)與國(guó)內(nèi)外其它母乳研究結(jié)果基本相似；（2）母乳脂肪酸中，大部分飽和脂肪酸（包括中鏈）主要結(jié)合在甘油三酯sn-2位上，而不飽和脂肪酸（ARA 和DHA 除外）主要分布在甘油三酯sn-1，3 位上，且分布比例相對(duì)穩(wěn)定，幾乎不隨泌乳期的延長(zhǎng)而變化；（3）不管泌乳期如何變化，母乳磷脂脂肪酸中的DHA 和ARA含量始終顯著高于其在母乳總脂肪酸中的含量；（4） 鑒于母乳脂肪酸在甘油三酯和磷脂結(jié)構(gòu)中的特殊分布，嬰兒配方乳粉脂質(zhì)母乳化研究不僅要關(guān)注對(duì)母乳總脂肪酸組成的模擬，更應(yīng)該注重對(duì)母乳甘油三酯結(jié)構(gòu)脂肪酸分布以及磷脂脂肪酸組成的模擬。