高文萱，閆建華，杜會(huì)英，張克強(qiáng)*

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，天津 300191；2.天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072）

規(guī)模化、集約化的畜禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展產(chǎn)生了大量養(yǎng)殖廢水，相對(duì)固體糞便來說，養(yǎng)殖廢水處理和利用率極低，嚴(yán)重制約了畜禽養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因養(yǎng)殖廢水含豐富的腐植酸等有機(jī)質(zhì)和氮、磷等植物營(yíng)養(yǎng)元素[1-2]，直接排放會(huì)對(duì)環(huán)境造成水體富營(yíng)養(yǎng)化的污染。在我國(guó)生態(tài)型畜禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的指導(dǎo)下，將養(yǎng)殖廢水進(jìn)行厭氧生物降解處理，產(chǎn)生的沼液養(yǎng)分全面作為一種優(yōu)質(zhì)的有機(jī)肥料源以肥水方式回歸土壤，既有效利用養(yǎng)殖廢水減少資源浪費(fèi)，又避免直接排放養(yǎng)殖廢水對(duì)環(huán)境的污染，是最佳的廢水處理和利用途徑，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有很好的應(yīng)用前景[3]。因此，在提倡生態(tài)農(nóng)業(yè)的今天，如何以沼液作為水肥安全高效地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，成為眾多學(xué)者的研究方向[4-5]。

反硝化過程與土壤氮素?fù)p失和溫室氣體排放密切相關(guān)，是施肥和土壤研究中的重點(diǎn)問題[6]。有研究者估計(jì)，全球70%的N2O排放來自農(nóng)田，其中農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的排放量約占25%[7]；此外，反硝化作用致使土壤喪失20%～30%的氮肥，是土壤肥力下降的重要原因[8]。反硝化是在硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶、NO還原酶和N2O還原酶連續(xù)催化下將NO-3還原為N2的過程。其中亞硝酸鹽還原酶（Nir）是反硝化作用中最關(guān)鍵的一步反應(yīng)，因而其編碼基因（nir）在反硝化研究中被廣泛用作分子標(biāo)記[9]。亞硝酸還原酶分為cd1-亞硝酸還原酶和Cu-亞硝酸還原酶兩種，分別由nirS和nirK基因編碼，兩者不能共存于一種微生物中[10]，nirS基因在反硝化菌中的存在比nirK更廣泛[10]。nirK基因存在于許多親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的菌株中，且分子量變化較大；而含有nirS基因的細(xì)菌以假單胞菌占優(yōu)勢(shì)，且在不同菌株中分子大小相似，形態(tài)結(jié)構(gòu)相對(duì)保守[11]。由nosZ基因編碼的N2O還原酶催化N2O轉(zhuǎn)化成N2，是反硝化過程的最后一步，對(duì)于減少N2O的排放意義重大[12-13]。

本研究以華北地區(qū)小麥-玉米輪作大田為研究對(duì)象，采用T-RFLP技術(shù)分析了不同牛場(chǎng)肥水濃度和灌溉次數(shù)下0～20 cm以及20～40 cm土層中nirS和nosZ群落結(jié)構(gòu)及多樣性變化，為牛場(chǎng)肥水的合理施用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

試驗(yàn)于2012年10月至2015年6月進(jìn)行，采樣地點(diǎn)為河北省保定市徐水縣梁家營(yíng)長(zhǎng)期定位牛場(chǎng)肥水灌溉試驗(yàn)田（115°32′6.67″E，38°56′43.63″N），土壤類型為潮褐土。徐水縣位于太行山東麓，河北省中部，屬暖溫帶季風(fēng)型大陸性氣候，四季分明，光照充足，海拔1200～2768 m，年平均氣溫12.3℃，年無霜期平均184 d，年均降水量546.9 mm，年日照時(shí)數(shù)平均2 744.9 h，屬華北平原典型農(nóng)業(yè)種植區(qū)。冬小麥-夏玉米輪作為當(dāng)?shù)刂饕霓r(nóng)業(yè)種植方式，當(dāng)年10月上旬種植冬小麥，次年6月中旬收獲小麥，約一周后種植夏玉米，當(dāng)年9月底收獲，玉米秸稈用于奶牛的飼養(yǎng)。該地區(qū)奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達(dá)，奶牛場(chǎng)41座，奶牛存欄數(shù)達(dá)到2.5×104頭，每年排放廢水5×105t。試驗(yàn)地種植前耕層土壤有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)24.5 g·kg-1、pH值7.76、全氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.39 g·kg-1、硝態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)13.09 mg·kg-1、銨態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.24 mg·kg-1、速效磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)64.19 mg·kg-1。試驗(yàn)土壤主要理化性質(zhì)見表1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品采集

試驗(yàn)共設(shè)8個(gè)處理，表2為各處理下的施肥時(shí)間、類型及成分。每處理設(shè)置3次重復(fù)，24個(gè)田間小區(qū)采用完全隨機(jī)區(qū)組排列。每個(gè)小區(qū)長(zhǎng)9 m，寬6 m，面積54 m2。試驗(yàn)小區(qū)灌溉采用畦灌，根據(jù)《華北地區(qū)冬小麥公頃產(chǎn)量6000 kg（畝產(chǎn)400 kg）栽培技術(shù)規(guī)程》（NY/T 205—1992），計(jì)算冬小麥需水量，所有處理灌水定額均為830 m3·hm-2，灌水量利用超聲波流量計(jì)計(jì)量，灌溉誤差1%以內(nèi)。冬小麥全生育期灌水4次，玉米生育期灌水1次。供試冬小麥品種為濟(jì)麥22、玉米為農(nóng)大221。試驗(yàn)灌溉用牛場(chǎng)肥水為經(jīng)過厭氧處理的牛糞尿和擠奶車間沖洗水，經(jīng)檢測(cè)符合《農(nóng)田灌溉水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》（GB 5084—2005），表3為厭氧處理后的灌溉肥水原液成分及含量。

表1 試驗(yàn)土壤基本性質(zhì)Table 1 Soil basic properties

表2 各個(gè)處理施肥量Table 2 Fertilizer amount in treatments

土壤樣品的采集：樣品采自小麥?zhǔn)斋@期（2015年6月12日），采集深度為0～20、20～40 cm兩個(gè)土層。采用五點(diǎn)取樣法，每個(gè)實(shí)驗(yàn)小區(qū)處理中采集5個(gè)土樣，將5點(diǎn)采集的土壤混合為1個(gè)樣品。田間采集的土樣保存于保鮮盒內(nèi)并迅速送至實(shí)驗(yàn)室，于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)將土樣去除根系、雜草等雜質(zhì)后混勻，-20℃冷凍保存用于土壤微生物分析。

1.3 分析方法

1.3.1 土壤總DNA的提取

土壤DNA的提取采用FastDNA SPIN Kit For Soil（MP Biomedicals，LLC）試劑盒方法。稱取500 mg的土壤樣品，按試劑盒提供的操作步驟進(jìn)行，以Fast-Prep?Instrument進(jìn)行細(xì)胞破碎處理，速度為6 m·s-1，時(shí)間40 s。提取的DNA在0.7%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)。DNA保存于-20℃的冰箱中備用。

1.3.2 反硝化菌群落結(jié)構(gòu)分析

反硝化菌群落結(jié)構(gòu)分析采用末端限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法分析（Terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP），利用反硝化菌nirS、nosZ基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（表4）。PCR產(chǎn)物用Mini BEST DNA Fragment Purification Kit VER 4.0（TaKaRa）試劑盒進(jìn)行純化回收，回收后的目的基因經(jīng)限制性內(nèi)切酶HhaI（TaKaRa）酶切分析。酶切后所得產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)。將獲得的T-RFLP數(shù)據(jù)繼續(xù)進(jìn)行處理，去除結(jié)果中小于50 bp及相對(duì)豐度小于1%的酶切片段。

1.3.3 序列系統(tǒng)發(fā)育分析

將各處理下的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均勻混合，經(jīng)切膠回收后連接至pMD19?-T Vector質(zhì)粒（Takara，大連）、轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞DH5a內(nèi)，37℃過夜培養(yǎng)，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取約100個(gè)陽性克隆子送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序分析，構(gòu)建克隆文庫。將測(cè)序所得序列利用Vector NTI 11.5.1軟件分析檢查去除嵌合及錯(cuò)誤序列后，在GeneBank數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.com）中進(jìn)行Blast比對(duì)。

表3 灌溉肥水原液成分及含量Table 3 The composition and content of cattle fertilizer biogas slurry

表4 PCR反應(yīng)中的引物及反應(yīng)條件Table 4 Primers and PCR conditions used for the PCR amplification

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

群落結(jié)構(gòu)分析通過計(jì)算3個(gè)群落多樣性指數(shù)（Diversity index）：香農(nóng)維納指數(shù)（Shannon-Wiener index）、辛普森優(yōu)勢(shì)度指數(shù)（Simpson index）、均勻性指數(shù)（Pielou index）。式中：Pi表示某個(gè)峰的峰面積占該樣點(diǎn)所有峰的總面積的比例；S表示T-RFs（T-RFs表示末端限制性片段）的個(gè)數(shù)。T-RFLP片段分布的影響的顯著性采用SPSS 17.0（IBM SPSS）單因素方差分析檢驗(yàn)，并進(jìn)行多重比較。利用CANOCO 4.5（Ter Braak&Smilauer，2012）基于T-RFLP圖譜中酶切片段的數(shù)值進(jìn)行兩土層中反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主成分分析（PCA）。系統(tǒng)發(fā)育分析采用 MEGA 5.0（Molecular Evolutionary Genetics Analysis），根據(jù)BLAST同源性比對(duì)的結(jié)果，從核酸數(shù)據(jù)庫中下載同源性高的不同分類來源的代表性nirS、nosZ序列，用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建nirS、nosZ反硝化細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥處理對(duì)兩土層nirS型反硝化菌群落的影響

利用反硝化細(xì)菌nirS基因特異引物對(duì)兩土層反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行T-RFLP分析，結(jié)果如圖1所示。經(jīng)HhaI酶切后，0～20 cm和20～40 cm土層分別得到22種和27種片段長(zhǎng)度，兩土層中都存在著豐富的nirS型反硝化細(xì)菌基因資源。0～20 cm土層中nirS基因酶切片段 68、83、102、112、160、166、169 bp和206 bp占全部片段百分比含量的75.60%～83.26%，為主要優(yōu)勢(shì)片段。不同肥水處理對(duì)0～20 cm土層中nirS型反硝化菌相對(duì)豐度均無顯著差異，說明0～20 cm土層中nirS型反硝化細(xì)菌對(duì)施肥種類、肥水濃度及灌溉次數(shù)等不同處理?xiàng)l件不敏感。20～40 cm土層中nirS基因代表的反硝化微生物群落組成在各施肥處理下發(fā)生變化，經(jīng)HhaI酶切后均得到6個(gè)主要片段68、98、112、160、166 bp和169 bp，占全部片段百分比含量的46.99%～60.85%，說明這些片段所代表的nirS型反硝化細(xì)菌在土壤中占優(yōu)勢(shì)。不同處理下6個(gè)主要片段相對(duì)豐度未發(fā)生明顯變化，但CF、T1、T2、T4和T5處理下出現(xiàn)片段58 bp且相對(duì)豐度較高，片段185 bp在T3處理下相對(duì)豐度顯著增加，片段83 bp比例在T4處理下相對(duì)豐度顯著增加，這些片段均上升為優(yōu)勢(shì)菌種；T1和T2處理下片段317 bp相對(duì)豐度明顯增加；T2、T4和T6處理下片段126 bp相對(duì)豐度顯著降低。

比較兩土層nirS型反硝化菌群落組發(fā)現(xiàn)，0～20 cm土層中片段102 bp相對(duì)豐度在各處理下平均為17.13%，顯著高于20～40 cm土層（1.55%）；20～40 cm的土層中出現(xiàn)了0～20 cm土層中沒有的76、91、98、105、126、235 bp新片段，其中98 bp和126 bp在各處理下的相對(duì)豐度較高，分別占11.31%、3.91%。上述T-RFLP結(jié)果表明，nirS型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在0～20、20～40 cm土層中存在一定的垂直分布差異，且0～20 cm土層中nirS型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對(duì)施肥種類、肥水濃度及灌溉次數(shù)不敏感，而20～40 cm土層中nirS型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對(duì)施肥條件敏感性提高。

對(duì)不同處理下兩土層中nirS型反硝化菌群落多樣性指數(shù)分析（表5）發(fā)現(xiàn)，無論是0～20 cm土層還是20～40 cm土層，大多數(shù)處理下nirS型反硝化菌的Shannon-Wiener H′指數(shù)、Simpson D指數(shù)和Pielou E指數(shù)沒有顯著的差別，表明實(shí)驗(yàn)條件下施肥種類及方式（肥水灌溉）對(duì)nirS基因多樣性影響不顯著。

根據(jù)nirS基因T-RFs數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（圖2）發(fā)現(xiàn)，在0～20 cm土層中，第一主成分（PC1）解釋了37.2%的物種組成變化，第二主成分（PC2）解釋了22.2%的物種組成。其中，CF與CK較為接近，而其他牛場(chǎng)肥水處理點(diǎn)與CK相距較遠(yuǎn)，說明肥水處理組對(duì)0～20 cm土層中nirS群落結(jié)構(gòu)影響比常規(guī)施肥CF更大。在20～40 cm土層中，第一主成分（PC1）解釋了31.0%的物種組成變化，第二主成分（PC2）解釋了25.1%的物種組成。所有處理點(diǎn)均遠(yuǎn)離CK，其中T5、T6與CF較為接近，說明施肥處理使20～40 cm土層中nirS群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，其中T5、T6處理下nirS群落結(jié)構(gòu)與常規(guī)施肥CF較為接近。

2.2 不同施肥處理對(duì)兩土層nirS型反硝化菌系統(tǒng)進(jìn)化分析

基于T-RFLP圖譜中處理的片段長(zhǎng)度的數(shù)量和比例的均勻性，選取0～20 cm和20～40 cm土層nirS基因建立克隆文庫，在兩土層nirS基因文庫中均選取約100個(gè)克隆子測(cè)序，通過登陸NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST分析，剔出假陽性克隆，與Genbank數(shù)據(jù)庫中已存在的序列進(jìn)行同源性比對(duì)，最終獲得了42個(gè)有代表性的操作分類單元（OTUs），進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果如圖3所示，測(cè)序獲得的nirS序列與其相似菌株的相似性在84%～99%之間。

圖1 不同處理?xiàng)l件下nirS型反硝化菌的T-RFLP圖譜Figure 1 T-RFLP fingerprints of nirS gene from soils under different regimes

表5 不同施肥水平處理下兩土層nirS基因多樣性指數(shù)Table 5 The diversity index of soil nirS denitrifying bacteria under different fertilizer treatments

根據(jù)序列在進(jìn)化樹上的分布，將nirS基因系統(tǒng)發(fā)育樹分為4個(gè)類群：其中，總克隆的46.3%分布在第Ⅰ個(gè)類群，主要包括0～20 cm土層的優(yōu)勢(shì)菌群102 bp（19）、166 bp（11）和20～40 cm土層的優(yōu)勢(shì)菌群98 bp（11）、112 bp（7）、160 bp（14），在系統(tǒng)進(jìn)化樹中，這些序列與β-變形菌綱的貪銅菌屬（Cupriavidus）、Thau-era菌屬和γ-變形菌綱的假單胞菌屬（Pseudomonas）聚類在一起，有較近的親緣關(guān)系。23.2%的克隆分布在第Ⅱ個(gè)類群，主要包括0～20 cm土層的優(yōu)勢(shì)菌群160 bp（6）、169 bp（6）和20～40 cm土層的優(yōu)勢(shì)菌群169 bp（6），這些序列與α-變形菌綱的副球菌屬（Paracoccus）和γ-變形菌綱的Rhodanobacter聚類在一起，有較近的親緣關(guān)系。11.2%的克隆分布在第Ⅲ個(gè)類群，此類群中20～40 cm土層的反硝化菌占到11.05%，包括20～40 cm土層的優(yōu)勢(shì)菌群50 bp（8）、166 bp（13），而0～20 cm土層僅占0.15%，與此類群相近的微生物為β-變形菌綱的Brachymonas、Alicycliphilus菌屬。18.9%的克隆分布在第Ⅳ個(gè)類群，主要包括0～20 cm土層的優(yōu)勢(shì)菌群112 bp（5）和20～40 cm土層的優(yōu)勢(shì)菌群68 bp（9），與此類群相近的微生物為β-變形菌綱的固氮弧菌屬（Azoarcus）、貪銅菌屬（Cupriavidus）、Ralstonia菌屬和γ-變形菌綱的Serratia菌屬。

2.3 不同施肥處理對(duì)兩土層nosZ型反硝化菌群落的影響

利用反硝化細(xì)菌nosZ基因特異引物對(duì)兩土層反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行T-RFLP分析，結(jié)果如圖4。在0～20 cm土層中nosZ基因經(jīng)HhaI酶切得到16個(gè)T-RFs片段。不同處理下片段59、177 bp和265 bp均出現(xiàn)且相對(duì)豐度較高，是共有的優(yōu)勢(shì)菌種，且在各處理下相對(duì)豐度無顯著變化。另外，片段54 bp在T2、T3、T4、T5和T6處理下相對(duì)豐度明顯上升，為優(yōu)勢(shì)菌種；片段91 bp在T5處理下相對(duì)豐度顯著增加，也成為該處理下的優(yōu)勢(shì)菌種；片段111 bp在T1、T3和T4處理下相對(duì)豐度顯著增加，成為該處理下的優(yōu)勢(shì)菌種；片段117 bp在除T2和T6處理外的其他處理中相對(duì)豐度均較高，為其他處理的優(yōu)勢(shì)菌種，不同施肥處理下0～20 cm土層nosZ型反硝化菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

20～40 cm土層中nosZ基因經(jīng)HhaI酶切產(chǎn)生了20個(gè)T-RFs片段，種類較0～20 cm土層豐富。片段111、265 bp在所有處理中均存在且相對(duì)豐度較高，是共有優(yōu)勢(shì)菌種。片段63 bp在CF、T1、T2、T3和T4處理下相對(duì)豐度明顯增加，成為這些處理下的優(yōu)勢(shì)菌種；片段111 bp在T1處理下相對(duì)豐度顯著增加；片段125 bp在T3和T4處理下相對(duì)豐度顯著增加，成為優(yōu)勢(shì)菌種；片段84、155 bp和194 bp在T5處理下相對(duì)豐度明顯增加，成為該處理下的優(yōu)勢(shì)菌種。片段63 bp在T6處理下相對(duì)豐度明顯減少，而片段155 bp和194 bp相對(duì)豐度相對(duì)增加，成為優(yōu)勢(shì)菌種。綜上可知，不同施肥處理下20～40 cm土層nosZ型反硝化菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。另外，比較兩土層發(fā)現(xiàn)20～40 cm土層中出現(xiàn)0～20 cm土層中沒有的片段63、111、84、87、125 bp和205 bp，且相對(duì)豐度較高，表明相同施肥條件下土壤0～20 cm與20～40 cm土層nosZ型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在一定差異。

圖2 不同施肥處理下兩土層中nirS型反硝化菌群落的PCA分析Figure 2 The PCA analysis of nirS denitrifying bacteria under different fertilizer treatments in soils

圖3 nirS型反硝化菌系統(tǒng)發(fā)育樹（鄰接法）Figure 3 Neighbour-joining phylogenetic tree of nirS gene sequences

對(duì)不同處理下兩土層中nosZ型反硝化菌群落多樣性指數(shù)分析（表6）發(fā)現(xiàn)，0～20 cm土層中T5處理下的Shannon-Wiener H′指數(shù)顯著高于T2和T6處理，Simpson D指數(shù)T5也高于T6，Pielou E指數(shù)均無顯著的差別；而20～40 cm土層T5處理下的Shannon-Wiener H′指數(shù)也高于T2和T6處理，但差異不顯著。比較T5（含氮量為 317 kg·hm-2）、T2（含氮量為 210 kg·hm-2）和T6（含氮量為126 kg·hm-2）處理，3個(gè)處理均為越冬期和拔節(jié)期灌溉，表明相同灌溉次數(shù)，高濃度肥水灌溉有利于兩土層中nosZ型反硝化菌群落多樣性發(fā)展。另外發(fā)現(xiàn)在20～40 cm土層中，T1處理Shannon-Wiener H′指數(shù)顯著低于其他處理，而T5處理Shannon-Wiener H′指數(shù)顯著高于CK、CF、T1和T4處理，表明T1處理能顯著降低nosZ型反硝化菌群落多樣性，T5處理相對(duì)其他處理更有助于增加nosZ群落多樣性。

圖4 不同處理?xiàng)l件下nosZ型反硝化菌的T-RFLP圖譜Figure 4 T-RFLP fingerprints of nosZ genes from soils under different regimes

表6 不同施肥水平處理下兩土層nosZ基因多樣性指數(shù)Table 6 The diversity index of nosZ denitrifying bacteria in soils under different fertilizer treatments

根據(jù)nosZ基因T-RFs數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（圖5）發(fā)現(xiàn)，在0～20 cm土層中，第一主成分（PC1）解釋了59.5%的群落結(jié)構(gòu)變化，第二主成分（PC2）解釋了16.1%的群落結(jié)構(gòu)變化。CF、T2和T6處理在PC1上距離CK較遠(yuǎn)，而T1、T3、T4和T5處理則在PC1上較為接近CK，說明T2、T3、T4和T5處理使0～20 cm土層中nosZ群落結(jié)構(gòu)變化較小，而T2和T6處理nosZ群落結(jié)構(gòu)變化較大，nosZ群落結(jié)構(gòu)展示出對(duì)肥水濃度及灌溉次數(shù)的敏感性。在20～40 cm土層中，第一主成分（PC1）解釋了68.1%的物種組成變化，第二主成分（PC2）解釋了16.2%的物種組成變化。T5在PC1和PC2上最接近CK，說明T5處理對(duì)20～40 cm土層nosZ群落結(jié)構(gòu)影響較??；T2、T3、T4與CF聚成一簇，說明這幾個(gè)處理nosZ群落結(jié)構(gòu)相似。

2.4 不同施肥處理對(duì)兩土層nosZ型反硝化菌系統(tǒng)進(jìn)化分析

基于T-RFLP圖譜中處理的片段長(zhǎng)度的數(shù)量和比例的均勻性，選取0～20 cm和20～40 cm土層nosZ基因建立克隆文庫，在兩土層nosZ基因文庫中均選取約100個(gè)克隆子測(cè)序，通過登陸NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST分析，剔出假陽性克隆，與Genbank數(shù)據(jù)庫中已存在的序列進(jìn)行同源性比對(duì)，最終獲得了35個(gè)有代表性的操作分類單元（OTUs），進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果如圖6所示，測(cè)序獲得的nosZ序列與其相似菌株的相似性在85%～99%之間。

圖5 不同施肥處理下兩土層中nosZ型反硝化菌群落的PCA分析Figure 5 The PCA analysis of nosZ denitrifying bacteria under different fertilizer treatments in soils

根據(jù)序列在進(jìn)化樹上的分布，將nosZ基因系統(tǒng)發(fā)育樹分為4個(gè)類群：其中，總克隆的39.7%分布在第Ⅰ個(gè)類群，主要包括0～20 cm土層的優(yōu)勢(shì)菌群54 bp（8）、59 bp（11）、177 bp（13）、265 bp（20）和 20～40 cm土層的優(yōu)勢(shì)菌群177 bp（7），另外包括兩個(gè)土層的次優(yōu)勢(shì)種群（如：0～20 cm土層的66、98 bp；20～40 cm土層的54、98、155、160 bp和255 bp等），在系統(tǒng)進(jìn)化樹中，這些序列與α-變形菌綱的根瘤菌屬（Rhizobium）和固氮螺菌屬（Azospirillum）、β-變形菌綱的貪銅菌屬（Cupriavidus）和γ-變形菌綱的假單胞菌屬（Pseudomonas）、絲硫菌屬（Thiothrix）聚類在一起，有較近的親緣關(guān)系。15.1%的克隆分布在第Ⅱ個(gè)類群，主要包括0～20 cm土層的54 bp（8）、87 bp（2）、91 bp（3）、111 bp（6）、136 bp（1）和20～40 cm土層的102 bp（3）、125 bp（4），這些序列與α-變形菌綱的中華根瘤菌屬（Sinorhizobium）和γ-變形菌綱的志賀氏菌屬（Shigella）聚類在一起，有較近的親緣關(guān)系。30.2%的克隆分布在第Ⅲ個(gè)類群，主要包括20～40 cm土層的優(yōu)勢(shì)菌群63 bp（9）、265 bp（14），此外還包括有Z1-226 bp（3）、Z1-255 bp（1）、Z1-194 bp（6）片段，Z2-226 bp（2）、Z2-265 bp（14）、Z2-63 bp（9）、Z2-87 bp（7）、Z2-91 bp（5）、Z2-194 bp（7）、Z2-74 bp（4）等片段，與此類群相近的微生物為γ-變形菌綱的假單胞菌屬（Pseudomonas）。15.1%的克隆分布在第Ⅳ個(gè)類群，主要包括20～40 cm土層的優(yōu)勢(shì)菌群111 bp（9），此外還包括有Z1-230 bp（1）、Z1-144 bp（3）、Z2-144 bp（2）、Z2-74 bp（4）、Z2-117 bp（2）、Z2-167 bp（1）、Z2-84 bp（5）等片段，與此類群相近的微生物為γ-變形菌綱的Steroidobacter菌屬和Pluralibacter菌屬。

3 討論

反硝化作用是在微生物參與下的土壤氮循環(huán)中的一個(gè)重要過程，反硝化作用強(qiáng)弱直接影響著氮素的利用[14]。杜會(huì)英等[15]研究發(fā)現(xiàn)，牛場(chǎng)肥水灌溉使冬小麥-夏玉米輪作體系作物累計(jì)氮利用率逐年升高，且顯著高于常規(guī)化肥處理。然而農(nóng)田施用氮肥會(huì)導(dǎo)致溫室氣體N2O的排放，通過管理氮肥的種類及用量則可在一定程度上控制N2O的排放[16]。沈仕洲等[17]研究發(fā)現(xiàn)，采用不同濃度奶牛場(chǎng)沼液灌溉都使N2O排放較清水增加，但不高于常規(guī)化肥排放值。可見，牛場(chǎng)肥水灌溉可能通過調(diào)節(jié)土壤反硝化過程提高了氮素利用率。

溫度、pH、水分、含氧量、碳氮類型和碳氮比以及土壤質(zhì)地、土壤利用和耕作方式等都對(duì)反硝化作用產(chǎn)生影響[14，18]。本研究各試驗(yàn)田的光照、土壤、作物、種植方式、灌溉次數(shù)與灌溉水量均相同，不同施肥方式主要通過pH、碳氮類型和碳氮量對(duì)反硝化微生物產(chǎn)生影響。因采用了長(zhǎng)期定位試驗(yàn)田，施肥模式從2012年10月持續(xù)到2015年6月，土壤性質(zhì)因長(zhǎng)期的施肥措施產(chǎn)生了一定差異（表1），施肥處理組（CF，T1～T6）的-N和-N普遍高于不施肥處理CK，這種差異反映了施肥措施的長(zhǎng)期影響；同樣，反硝化微生物群落結(jié)構(gòu)的改變也反映了在施肥措施影響下的長(zhǎng)期適應(yīng)結(jié)果。本研究中nirS型反硝化細(xì)菌主要與假單胞菌屬（Pseudomonas）、副球菌屬（Paracoccus）、貪銅菌屬（Cupriavidus）具有較近的親緣關(guān)系；而nosZ型反硝化細(xì)菌與假單胞菌屬（Pseudomonas）、根瘤菌屬（Rhizobium）、固氮螺菌屬（Azospirillum）、貪銅菌屬（Cupriavidus）等具有較近的親緣關(guān)系，這些菌屬與已知報(bào)道吻合[14，18]。

圖6 nosZ型反硝化菌系統(tǒng)發(fā)育樹（鄰接法）Figure 6 Neighbour-joining phylogenetic tree of nosZ gene sequences

現(xiàn)有報(bào)道nirS型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對(duì)施肥條件的響應(yīng)存在矛盾，如宋亞娜等[19]研究發(fā)現(xiàn)施用氮肥對(duì)稻田土壤的nirS型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)沒有明顯影響；Yin等[20]發(fā)現(xiàn)，我國(guó)南方水稻土中nirS型反硝化菌的群落結(jié)構(gòu)對(duì)施加無機(jī)肥和有機(jī)肥處理均沒有顯著的響應(yīng)；另一些研究則表明nirS對(duì)施肥有明顯響應(yīng)，如莫旭華等[21]發(fā)現(xiàn)，不同類型的反硝化細(xì)菌對(duì)無機(jī)氮肥的反應(yīng)不同而導(dǎo)致了nirS型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)改變，但未改變nirS型反硝化細(xì)菌的多樣性；王婷等[22]研究發(fā)現(xiàn)牛場(chǎng)肥水施用改變了0～5 cm表層土中nirS型反硝化細(xì)菌的多樣性。本研究發(fā)現(xiàn)施肥種類及施肥方式對(duì)0～20 cm土層nirS型反硝化細(xì)菌群落組成無顯著影響，但對(duì)20～40 cm土層nirS型反硝化細(xì)菌有一定影響，這與前述兩種報(bào)道都有吻合之處。這可能是由于nirS型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)更易受土壤異質(zhì)性（土層深度）的影響。本研究還發(fā)現(xiàn)施肥措施的不同對(duì)兩土層nosZ型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有明顯的影響，nosZ型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對(duì)施肥種類及施肥方式更為敏感。有研究顯示nirS基因的分布與樣品所處的環(huán)境類型有關(guān)，nirS基因序列在不同的環(huán)境類型中存在的差異非常大，即使在土壤環(huán)境相同的情況下，nirS基因的序列也存在很大的不同[23]；另外，Ishii等[24]研究亦發(fā)現(xiàn)對(duì)土壤環(huán)境變化響應(yīng)的反硝化菌種群具有土壤的特異性，這在一定程度上解釋了兩土層中nirS型反硝化菌對(duì)不同施肥處理的不同響應(yīng)。兩土層nirS型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對(duì)施肥條件的響應(yīng)是綜合了0～20 cm和20～40 cm土層不同環(huán)境因素影響的結(jié)果，如水分、NO-3-N含量和氧分壓等因素，本實(shí)驗(yàn)中施肥條件下兩土層土壤水分含量相近，可見水分不是導(dǎo)致兩土層中施肥條件下nirS型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征變化不同的原因。土壤中反硝化細(xì)菌的分布與土壤環(huán)境中NO-3-N濃度及氧分壓密切相關(guān)[25-26]，NO-3-N是反硝化作用的底物，本實(shí)驗(yàn)中施肥條件下兩土層的NO-3-N含量變化差異明顯，另外20～40 cm土層較之0～20 cm氧分壓明顯較低，施肥處理下土壤低氧含量的20～40 cm土層環(huán)境可能更適合nirS型反硝化細(xì)菌的生存，使得適合在該環(huán)境條件下生存的反硝化細(xì)菌的種類及豐度增加，逐漸取代了數(shù)量較少且不適宜在該環(huán)境下生存的反硝化細(xì)菌，從而成為優(yōu)勢(shì)種群并發(fā)揮重要作用[27]，所以NO-3-N含量和氧分壓等綜合因素的影響可能是導(dǎo)致兩土層中施肥條件下nirS、nosZ型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征變化不同的原因。

對(duì)nirS、nosZ基因的多樣性指數(shù)的研究顯示實(shí)驗(yàn)條件下施肥種類及方式對(duì)nirS、nosZ基因多樣性指數(shù)影響不同。不同施肥處理?xiàng)l件下兩土層nosZ型反硝化細(xì)菌群落組成受肥水灌溉及灌溉次數(shù)等的環(huán)境變化影響顯著，說明土壤nosZ型反硝化微生物群落多樣性指數(shù)受到施肥的影響，這與之前研究相一致，如Enwall等[28-29]研究發(fā)現(xiàn)nosZ型反硝化細(xì)菌的群落對(duì)有機(jī)肥敏感，氮肥可導(dǎo)致nosZ型反硝化細(xì)菌多樣性降低，Chen等[30]研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期單施氮肥可提高nosZ基因型反硝化細(xì)菌群落多樣性，Patrick等[31]研究發(fā)現(xiàn)nosZ型反硝化細(xì)菌的多樣性和豐度隨著氮輸入的增加而增加。本研究還發(fā)現(xiàn)，盡管不同施肥處理改變了20～40 cm土層nirS型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，但并未對(duì)多樣性造成顯著改變，說明這種改變主要是優(yōu)勢(shì)菌群與劣勢(shì)菌群位置的互換，并未顯著增加菌群的種類，因此整體多樣性改變不大。另外不同施肥處理?xiàng)l件下土壤nosZ型反硝化微生物群落多樣性指數(shù)影響也存在差異，相同施氮量（約300 kg·hm-2）的CF、T5和T3處理下相比常規(guī)施肥處理較高濃度肥水灌溉（T5）能更好地促進(jìn)兩土nosZ基因多樣性發(fā)展。本研究還發(fā)現(xiàn)0～20 cm土層中的nirS、nosZ基因的3個(gè)多樣性指數(shù)低于20～40 cm土層，原因可能在于施肥條件下0～20 cm土層中nirS、nosZ型反硝化細(xì)菌片段的種類不及20～40 cm土層豐富，反硝化菌可以在厭氧環(huán)境下更好地生存的結(jié)果。

4 結(jié)論

nirS型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在0～20、20～40 cm土層中存在一定的垂直分布差異，且0～20 cm土層中nirS群落結(jié)構(gòu)對(duì)施肥種類、肥水濃度及灌溉次數(shù)不敏感，而20～40 cm土層中nirS群落結(jié)構(gòu)對(duì)施肥條件敏感性提高。兩土層nosZ型反硝化細(xì)菌群落均對(duì)施肥條件較為敏感。

相同灌溉次數(shù)，較高肥水濃度灌溉（T5處理：含氮為317 kg·hm-2，清水∶沼液=1∶1）有利于兩土層中nosZ型反硝化菌群落多樣性發(fā)展，而較低濃度肥水灌溉1次（T1處理：含氮為105 kg·hm-2）顯著降低20～40 cm土層中nosZ型反硝化菌群落多樣性。不同施肥條件不改變兩土層nirS群落多樣性。

本實(shí)驗(yàn)所得到的nirS、nosZ序列均來自細(xì)菌中的變形菌綱，主要與α、β、γ-變形菌綱相近，且分布廣泛。