車 濤，張麗萍，金竹萍，裴雁曦*

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原 030006；2.特色植物資源研究與利用山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030006）

近年來，隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的迅速發(fā)展，我國土壤重金屬污染愈演愈烈，造成的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失越來越嚴(yán)重[1]，特別是耕地重金屬污染會(huì)直接影響農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量和品質(zhì)，危害人體健康，因此了解植物對重金屬脅迫的應(yīng)答機(jī)理成為近幾年的研究熱點(diǎn)。鎘（Cd）是其中一種毒性強(qiáng)且污染范圍廣的重金屬。已有研究表明，Cd能夠引起植物體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)紊亂，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能[2]，使植物葉綠素、糖及蛋白質(zhì)合成受阻[3]，降低碳同化作用，抑制光合及呼吸作用[4]，甚至最終導(dǎo)致植物死亡。氣體信號(hào)分子硫化氫（H2S）被報(bào)道可以緩解重金屬對植物的毒害作用[5-6]，而關(guān)于Cd脅迫下H2S對植物光合作用的調(diào)節(jié)鮮有報(bào)道。

H2S是目前公認(rèn)的除一氧化氮（NO）、一氧化碳（CO）之外的第三種氣體信號(hào)分子，在參與植物生長發(fā)育、調(diào)節(jié)植物抵抗多種逆境方面我們已取得了諸多進(jìn)展[6]。植物在遭受到重金屬脅迫時(shí)，體內(nèi)的H2S合成增加，其能夠促進(jìn)小分子抗氧化劑還原型谷胱甘肽、抗壞血酸合成，同時(shí)增強(qiáng)一系列抗氧化酶活性來調(diào)控細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的平衡，降低脅迫造成的氧化損傷[7]。H2S可以通過提高植物細(xì)胞膜上Na+-ATPase、K+-ATPase和H+-ATPase的活性來減少對Al的吸收[8]；另外可激活液泡膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)通道，將胞質(zhì)中Cd2+轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡，降低胞質(zhì)內(nèi)重金屬離子的濃度[9]。外源H2S還可以通過促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)葉綠體類囊體的發(fā)育，增加線粒體數(shù)目來緩解Cd脅迫[10]。

光合作用是植物生長和生物量遞增所必需的重要生理過程，對重金屬離子的作用較為敏感[11]。Rubp羧化酶（Ribulose-1，5-hisphpsphate carboxylase）是植物光合作用過程中固定CO2的關(guān)鍵酶，RBCS基因編碼Rubp羧化酶的小亞基，小亞基控制Rubp羧化酶的催化效率，大多數(shù)高等植物包含4～10個(gè)RBCS基因[12-13]。大白菜是十字花科蕓薹屬一年或兩年生草本，栽培面積和消費(fèi)量居各類蔬菜之首，是北方重要的經(jīng)濟(jì)作物。本研究旨在探討外源H2S對Cd脅迫下大白菜幼苗生長、光合特性、葉綠素?zé)晒鈪?shù)及光合碳同化效率的影響，為H2S調(diào)節(jié)植物抗逆在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)植物材料獲取

供試材料為津育75號(hào)大白菜。挑選籽粒飽滿、大小均勻一致的大白菜種子，4℃浸泡過夜后，將種子均勻播種在90 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿底部鋪一層濾紙，每皿30粒。23℃黑暗培養(yǎng)2 d，然后在23℃，相對濕度60%，光照強(qiáng)度3000 lx，光照周期16 h/8 h（晝夜），每皿每天補(bǔ)充1/2 MS培養(yǎng)液5 mL，保證幼苗生長所需的營養(yǎng)，培養(yǎng)7 d后進(jìn)行處理。

1.2 Cd脅迫處理

以CdCl2配制成 1、2.5、5、10、15 mmol·L-1的處理液，每個(gè)濃度3皿，每皿加5 mL，對照為蒸餾水處理。在12 h和24 h后進(jìn)行生理指標(biāo)測定。

1.3 H2S相關(guān)處理

CK組：蒸餾水處理；CdCl2組：5 mmol·L-1CdCl2溶液處理12 h，光合作用指標(biāo)在此濃度幾乎都為半抑制；NaHS組：5 μmol·L-1NaHS熏蒸12 h，實(shí)驗(yàn)室之前得到的對大白菜Cd脅迫有緩解作用的預(yù)處理濃度為5 μmol·L-1；HT（次?；撬?，H2S清除劑）組：0.1 mmol·L-1HT處理12 h；NaHS+CdCl2組：5 μmol·L-1NaHS熏蒸幼苗12 h后，皿中加5 mmol·L-1CdCl2溶液再處理12 h；HT+CdCl2組：0.1 mmol·L-1HT處理幼苗12 h后加5 mmol·L-1CdCl2溶液處理12 h。熏蒸裝置為容積7 L的透明玻璃罩，將相應(yīng)濃度的NaHS溶液分別加入1.5 mL離心管，開蓋暴露在玻璃罩內(nèi)進(jìn)行熏蒸處理，其余處理組內(nèi)放入盛有蒸餾水的離心管。將HT溶液加入培養(yǎng)皿中，CK組加入等量蒸餾水，所有實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行12 h處理后，去掉玻璃罩進(jìn)行Cd脅迫。

1.4 光合指標(biāo)的測定

用乙醇提取法測定大白菜幼苗葉綠素含量；AquaPen-C AP-C 100掌上水體葉綠素?zé)晒鈨x（Photon systems instruments）測定光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）最大光能轉(zhuǎn)化率（Fv/Fm）、PSⅡ潛在活性（Fv/F0）和以吸收光能為基礎(chǔ)的性能指數(shù)（PIabs）；在光源充足且穩(wěn)定的情況下，使用SY-1020光合作用測定儀（中國河北省石家莊世亞科技有限公司）對凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、蒸騰速率（Tr）以及胞間二氧化碳濃度（Ci）等大白菜幼苗的光合特性相關(guān)指數(shù)進(jìn)行檢測。

1.5 Rubp羧化酶活性的測定

Rubp羧化酶活性的測定參照王維光等[14]的方法，以每分鐘催化1 μmol CO2固定所需的酶量為一個(gè)活力單位（U）。

1.6 H2S含量的測定

葉片H2S含量測定參考金竹萍等[15]的方法。鹽酸與植物組織勻漿直接反應(yīng)釋放H2S，放出的H2S在氧化劑FeCl3作用下，與N，N-二甲基-苯二胺反應(yīng)生成的亞甲基藍(lán)在670 nm處有強(qiáng)吸收峰可被檢測，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到濃度，H2S含量=H2S濃度×測定體積/鮮質(zhì)量。

1.7 大白菜幼苗RBCS基因表達(dá)量的檢測

提取大白菜幼苗的總RNA，Real-Time PCR檢測，熒光染料為SYBR GreenⅠ，使用Applied Biosystems 7500 Fast熒光定量 PCR 儀，2-ΔΔC法分析基因表達(dá)水平。

1.8 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

依據(jù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示（M±SD）。使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行Duncan檢驗(yàn)，分析處理組間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd脅迫對大白菜幼苗葉片生長及光合特性的影響

2.1.1 對大白菜幼苗葉片生長的影響

對大白菜幼苗進(jìn)行不同濃度Cd處理后，發(fā)現(xiàn)Cd脅迫對大白菜幼苗生長有明顯的抑制作用（圖1）?！?.5 mmol·L-1處理組葉片明顯失綠，且萎蔫卷曲；隨著處理時(shí)間的延長，Cd對生長的抑制作用加重。

2.1.2 對大白菜幼苗光合特性的影響

圖1 Cd脅迫對大白菜幼苗生長狀況的影響Figure 1 The cabbage seedlings growth status under Cd stress

圖2 Cd脅迫對大白菜幼苗葉綠素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響Figure 2 Influences of Cd treatment on chlorophyll content and chlorophyll fluorescence parameters of cabbage seedlings

如圖2A所示，不同處理時(shí)間下，Cd對葉綠素影響趨勢一致，即隨著Cd濃度升高（＞2.5 mmol·L-1），葉綠素含量與對照組相比顯著降低（P＜0.05）。葉綠素吸收的光能主要流向3個(gè)方向：光合作用、熱耗散、激發(fā)葉綠素?zé)晒?，因此檢測葉綠素?zé)晒饪梢蚤g接反映光合作用的情況。受到Cd脅迫后，大白菜幼苗葉綠素含量、葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fo、Fv/Fm在處理濃度為1、2.5 mmol·L-1時(shí)與對照組相比變化不顯著（P＞0.05），當(dāng)處理濃度達(dá)到 5 mmol·L-1時(shí)，F(xiàn)v/Fo和Fv/Fm分別下降 18.7% 和 20.2%（P＜0.05）（圖 2B、圖2C）。葉綠素?zé)晒鈪?shù)PIabs從Cd處理濃度為1 mmol·L-1時(shí)就開始隨著處理濃度的增加而逐漸下降，在Cd濃度為15 mmol·L-1時(shí)，與對照組相比下降了46%（P＜0.05）（圖2D）。以上結(jié)果表明，高濃度Cd脅迫對大白菜幼苗光能的吸收和光化學(xué)反應(yīng)都有抑制作用。

大白菜幼苗葉綠素含量和葉綠素?zé)晒庠贑d脅迫下均受到影響，因此葉片光合作用速率也必然受到影響。測定光合作用相關(guān)指標(biāo)后發(fā)現(xiàn)，在不同處理時(shí)間段內(nèi)，當(dāng)Cd濃度達(dá)到5 mmol·L-1時(shí)，Pn、Tr和Gs3個(gè)指標(biāo)均開始顯著降低（P＜0.05），分別下降為對照組的20%、42%和65%（圖3），而Ci呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢。

2.2 H2S對Cd脅迫下大白菜幼苗葉片生長及光合特性的影響

2.2.1 H2S對Cd脅迫下大白菜幼苗內(nèi)源H2S含量的影響

藥理學(xué)處理后檢測大白菜幼苗葉片中的H2S含量（圖4）。單獨(dú)Cd和單獨(dú)H2S處理后H2S含量顯著升高（P＜0.05）；HT能有效清除大白菜幼苗體內(nèi)H2S，HT+Cd處理組與單獨(dú)Cd處理組相比H2S含量顯著降低了56.9%（P＜0.05）。

2.2.2 H2S對Cd脅迫下大白菜幼苗葉片生長的影響

從圖5可以看出，對照組和H2S、HT單獨(dú)處理組的大白菜幼苗生長無明顯變化，H2S熏蒸再經(jīng)Cd脅迫的幼苗與單獨(dú)Cd處理組相比，葉片的萎蔫卷曲程度有明顯緩和，相對長勢較好，而經(jīng)HT預(yù)處理后Cd脅迫下的大白菜幼苗與單獨(dú)Cd處理組相比長勢較弱，葉片萎蔫卷曲嚴(yán)重。Cd脅迫會(huì)顯著抑制大白菜幼苗的生長，施加外源H2S在一定程度上可以顯著促進(jìn)Cd脅迫下大白菜幼苗的生長。

圖3 Cd脅迫對大白菜幼苗葉片凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度和胞間二氧化碳濃度的影響Figure 3 The cabbage seedlings Pn，Tr，Gs and Ci under Cd stress

圖4 不同處理對大白菜幼苗H2S含量的影響Figure 4 The content of H2S in cabbage seedlings with different treatments

圖5 H2S對Cd脅迫下大白菜幼苗生長狀況的影響Figure 5 Influences of H2S on growth statu of cabbage seedlings under Cd stress

2.2.3 H2S對Cd脅迫下大白菜幼苗光合特性的影響

H2S減輕Cd毒害大白菜幼苗的萎蔫缺綠，可能是通過提高葉綠素含量和葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度來實(shí)現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期一致，葉綠素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)經(jīng)不同處理之后變化趨勢相似，二者在經(jīng)H2S預(yù)處理后顯著升高（圖6）。H2S+Cd處理后的相關(guān)指標(biāo)均較單獨(dú)Cd處理組顯著提高（P＜0.05），其中葉綠素含量升高了 50%，F(xiàn)v/F0、Fv/Fm和PIabs分別升高了 19.4%、14.6%和69.4%，而在HT+Cd處理下無顯著（P＞0.05）變化。結(jié)果表明H2S可以提高Cd脅迫下大白菜幼苗葉綠素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)，從而增強(qiáng)Cd脅迫下大白菜幼苗的光能吸收和轉(zhuǎn)化。

外源施加H2S能夠提高Cd脅迫時(shí)大白菜幼苗光合作用色素的含量，那么是否有助于光合速率的提高？進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)，H2S預(yù)處理使大白菜幼苗葉片凈光合速率Pn顯著升高了66.7%（P＜0.05）；與Cd脅迫相比，大白菜幼苗葉片Pn在H2S+Cd處理下升高了3.5倍（P＜0.05），而在HT+Cd處理下無顯著變化（P＞0.05）（圖7A）；H2S和HT處理大白菜幼苗葉片Tr和Gs與對照組在同一水平，同時(shí)H2S+Cd和HT+Cd處理組與單獨(dú)Cd處理組相比差異也不明顯，表明H2S對大白菜幼苗葉片Cd脅迫下的Tr和Gs沒有影響（圖7B、圖7C）。H2S和HT處理葉片后Ci沒有變化，Cd脅迫后Ci顯著升高（P＜0.05），進(jìn)而抑制了大白菜的光合作用，H2S+Cd處理下的白菜幼苗與單獨(dú)Cd處理相比Ci有顯著的降低（P＜0.05，圖7D）。該結(jié)果表明H2S預(yù)處理可以提高Cd脅迫下大白菜幼苗的凈光合速率。

圖6 H2S對Cd脅迫下大白菜幼苗葉綠素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響Figure 6 Influences of H2S on chlorophyll content and chlorophyll fluorescence parameters of cabbage seedlings under Cd stress

圖7 H2S對Cd脅迫下大白菜幼苗葉片凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度和胞間二氧化碳濃度的影響Figure 7 Influences of H2S on Pn，Tr，Gs and Ci in cabbage seedling leaves under Cd stress

2.3 H2S對Cd脅迫下大白菜幼苗Rubp羧化酶活性及RBCS基因的影響

圖8 H2S對Cd脅迫下大白菜幼苗葉片Rubp羧化酶活性的影響Figure 8 Influences of H2S on rubisco carboxylase activity in cabbage seedling leaves under Cd stress

從圖8可以看出，H2S處理可以顯著提高Rubp羧化酶的活性，HT單獨(dú)處理與對照組相比無顯著變化，Cd脅迫下大白菜幼苗葉片Rubp羧化酶活性與對照組相比下降了55.7%，受到顯著抑制（P＜0.05），H2S+Cd處理組與單獨(dú)Cd處理組相比無顯著變化，HT+Cd處理組與對照組相比Rubp羧化酶活性顯著下降了67%（P＜0.05），相對單獨(dú)Cd處理組降幅更大，該結(jié)果表明內(nèi)源H2S參與了大白菜幼苗響應(yīng)Cd脅迫的過程，可以在一定程度上緩解Cd脅迫對大白菜幼苗Rubp羧化酶活性的抑制作用。

在Cd脅迫條件下，大白菜幼苗RBCS1A、RBCS1B-1、RBCS1B-2、RBCS3B-1、RBCS3B-2的表達(dá)量被顯著抑制（P＜0.05），而 H2S+Cd處理中RBCS1A、RBCS1B-1、RBCS1B-2、RBCS2B、RBCS3B-1、RBCS3B-2的表達(dá)量顯著高于Cd處理（P＜0.05），HT+Cd處理對RBCS1A基因表達(dá)的抑制作用較單獨(dú)Cd脅迫程度更強(qiáng)。外源H2S可以提高RBCS基因家族 中RBCS1A、RBCS1B-1、RBCS1B-2、RBCS2B、RBCS3B-1、RBCS3B-2的表達(dá)量，并且可以在一定程度上緩解由于Cd脅迫造成的表達(dá)抑制（圖9）。

3 討論

圖9 H2S對Cd脅迫下大白菜幼苗葉片RBCS基因表達(dá)量的影響Figure 9 Influences of H2S on the expression of RBCS genes in cabbage seedlings under Cd stress

本研究發(fā)現(xiàn)正常生長條件下H2S預(yù)處理通過提高大白菜幼苗Pn增加其葉片光合作用速率，這一結(jié)果與Chen等[16]的研究中H2S提高光合作用的結(jié)果一致。在逆境中，主要通過Ci值的大小判斷植物Pn降低是由氣孔限制還是非氣孔限制因素引起的：當(dāng)Pn、Gs、Ci同時(shí)減小時(shí)，Pn的下降是由氣孔限制因素引起的；當(dāng)Pn、Gs減小，Ci增大時(shí)，Pn的下降是由非氣孔限制因素引起的[17]。在本實(shí)驗(yàn)中，H2S增強(qiáng)Cd脅迫下大白菜幼苗的光合作用強(qiáng)度可能是通過非氣孔限制因素作用的，這與王鴻蕉等[18]的研究結(jié)果H2S僅通過直接影響白菜幼苗葉片的Pn和Ci來提高冷脅迫下白菜幼苗的光合作用強(qiáng)度一致。而有研究[19]報(bào)道，H2S通過誘導(dǎo)干旱脅迫下擬南芥氣孔關(guān)閉維持較高的Ci，從而提高光合作用強(qiáng)度，與我們的結(jié)果相矛盾，初步推測可能是由于植物在響應(yīng)不同的環(huán)境脅迫時(shí)，H2S對氣孔運(yùn)動(dòng)的調(diào)控有所差異，從而導(dǎo)致光合作用強(qiáng)度與氣孔開度之間并沒有特定的相關(guān)性。

葉綠素是光合作用的主要色素，葉綠素含量與光合作用強(qiáng)弱直接相關(guān)。葉綠素?zé)晒鈪?shù)分別代表PSⅡ反應(yīng)中心光合量子轉(zhuǎn)換和光化學(xué)效率，兩者可以反映植物光合作用強(qiáng)弱及生長狀態(tài)，是研究環(huán)境脅迫對植物光合作用影響的重要參數(shù)[20]。本研究中，外源H2S預(yù)處理可以顯著提高Cd脅迫下大白菜幼苗Fv/Fo、Fv/Fm、PIabs的值和葉綠素含量，說明外源 H2S可以通過調(diào)控PSⅡ反應(yīng)中心的電子傳遞，提高熒光強(qiáng)度，同時(shí)促進(jìn)葉綠素合成，提高Cd脅迫下大白菜幼苗的光合作用強(qiáng)度，促進(jìn)白菜的生長。

Rubp羧化酶是光合作用的限速酶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HT+Cd處理下大白菜幼苗的Rubp羧化酶活性與單獨(dú)Cd脅迫處理相比受到的抑制作用更為明顯，表明內(nèi)源H2S通過參與調(diào)節(jié)大白菜幼苗Rubp羧化酶的活性來增強(qiáng)光合作用。Rubp羧化酶在擬南芥中有4個(gè)小亞基，分別為1A、1B、2B、3B，用擬南芥的小亞基序列在大白菜數(shù)據(jù)庫中比對出6條編碼小亞基的基因序列。外源H2S處理后，大白菜5個(gè)小亞基RBCS的表達(dá)量上調(diào)，但是Cd脅迫下大白菜Rubp羧化酶的活性卻沒有顯著提高。有研究發(fā)現(xiàn)Rubp羧化酶的活性是由大小亞基共同決定的[13]。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能是因?yàn)镠2S雖然提高了小亞基的表達(dá)量，但是缺乏足夠量大亞基的匹配，造成整體活性的不足；也可能是Cd毒性對酶活性有強(qiáng)烈的影響，即使在酶總量增加的情況下，這種毒性仍然抑制了Rubp羧化酶的活性。Chen等[16]研究發(fā)現(xiàn)，正常生長條件下生理濃度的H2S可以通過促進(jìn)Rubp羧化酶活性以及其大亞基蛋白表達(dá)來提高光合作用速率。這一結(jié)論與本研究的結(jié)論有不同之處，可能是不同物種間存在差異，也可能是研究方法間的差異，值得深入探討。

H2S的作用機(jī)制一直是H2S領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，目前已經(jīng)揭示的H2S的作用機(jī)制有涉及到蛋白質(zhì)硫巰基化修飾、與其他信號(hào)的互作以及通過ROS發(fā)揮作用等方面。關(guān)于H2S對光合作用的影響，就已有文獻(xiàn)來看可能有以下幾方面的作用方式：NO信號(hào)能增強(qiáng)冷脅迫下大白菜幼苗的光合作用強(qiáng)度[21]，H2S與NO之間存在互作關(guān)系也已經(jīng)有研究報(bào)道證實(shí)[22]；外源H2S可以增強(qiáng)水楊酸（SA）對植物應(yīng)對Cd脅迫的耐受，SA對Cd脅迫下葉綠素含量的緩解作用需要H2S的參與[23]；H2S通過巰基化修飾目的蛋白來調(diào)節(jié)其活性[24]，因此其作用方式除了對光合相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平影響，極有可能還通過翻譯后修飾的方式介導(dǎo)光合相關(guān)蛋白的活性調(diào)節(jié)。在本研究中，我們只探討了H2S對Rubp羧化酶小亞基轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量的影響，對其他影響植物光合作用的因素進(jìn)行系統(tǒng)深入的探討仍是一個(gè)令人好奇和充滿挑戰(zhàn)的研究領(lǐng)域。

4 結(jié)論

（1）H2S可以促進(jìn)Cd脅迫下大白菜幼苗葉綠素合成，提高葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度。

（2）Cd脅迫下，H2S通過調(diào)節(jié)Pn和Ci增加大白菜幼苗的光合作用速率，促進(jìn)其生長。

（3）H2S調(diào)節(jié)Rubp羧化酶活性并不完全依賴于小亞基。