□ 楊麗霞 長(zhǎng)沙市食品藥品檢驗(yàn)所

金黃色葡萄球菌是革蘭式陽(yáng)性球菌中最為常見的一種，其廣泛存在于自然界，可引起食物中毒、腦膜炎、骨髓炎、心內(nèi)膜炎等疾病[1]。金黃色葡萄球菌是細(xì)菌性食物中毒事件的主要誘發(fā)因子[2]，因此準(zhǔn)確快速地檢測(cè)金黃色葡萄球菌對(duì)食品安全檢測(cè)工作來(lái)說(shuō)非常重要。目前，針對(duì)金黃色葡萄球菌的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法主要是微生物培養(yǎng)法，但需要增菌、分離、生化鑒定等步驟，檢測(cè)時(shí)間通常在4天以上[3]。該方法基于致病菌的生長(zhǎng)代謝，操作復(fù)雜且檢測(cè)周期較長(zhǎng)，無(wú)法滿足現(xiàn)場(chǎng)快速、準(zhǔn)確檢測(cè)的要求。本研究擬運(yùn)用金黃色葡萄球菌特異性單、多克隆抗體，在微間隙陣列電極上包被多克隆抗體用于捕獲目標(biāo)物，當(dāng)目標(biāo)物存在時(shí)，單克隆抗體特異性識(shí)別目標(biāo)物就會(huì)形成三明治結(jié)構(gòu)的免疫復(fù)合物，體系中的堿性磷酸酶可將銀離子還原，而形成的銀單質(zhì)沉淀在電極表面及其間隙中。與此同時(shí)，電極間的電導(dǎo)率與銀單質(zhì)的沉淀量呈線性關(guān)系，可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的定量分析[4]。本方法具有精準(zhǔn)快速、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，可用于金黃色葡萄球菌及其它食源性致病菌的快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、沙門氏菌[CMCC（B）50115]、大腸桿菌O157:H7（ATCC 43889）、副溶血性弧菌（ATCC 17802）、阪崎腸桿菌（CICC 21561）、蠟樣芽胞桿菌[CMCC（B）63303]、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（ATCC 19115）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853），以上菌株均購(gòu)買自相應(yīng)的菌種保藏中心。

抗金黃色葡萄球菌多克隆抗體、單克隆抗體，購(gòu)自上?；墼派锟萍加邢薰?；堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AP）標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、抗壞血酸磷酸酯（ascorbic acid 2-phosphatase，AAP），購(gòu)自sigma公司；AgNO3、甘氨酸，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

主要儀器：CHI760D電化學(xué)工作站，上海辰華儀器公司；LRH-250F數(shù)顯恒溫器，上海一恒科技有限公司；微間隙陣列電極傳感器件，實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)[4]。

1.2 菌液準(zhǔn)備

菌種活化后，菌液用麥?zhǔn)媳葷峁軠y(cè)定其濃度，滅活后用生理鹽水稀釋制備成不同濃度的菌懸液。

1.3 試驗(yàn)方法

微間隙陣列電極用無(wú)水乙醇和超純水清洗后晾干；工作芯片用5μg/mL金黃色葡萄球菌多克隆抗體包被；加入1%脫脂奶粉溶液200μL，在37℃恒溫孵育1h，封閉芯片表面未結(jié)合抗體的位點(diǎn)；加入滅活菌液100μL，37℃孵育1h；加入5μg/mL金黃色葡萄球菌單克隆抗體100μL，37℃孵育30min；加入AP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG 100μL，37℃孵育30min；加入含1mmol/L AAP和5mmol/L AgNO3的底物溶液100μL，37℃避光孵育10min，用超純水清洗3次，晾干后待測(cè)。

將微間隙陣列電極傳感器的電極與電化學(xué)工作站的工作電極連接，采用線性掃描伏安法在0～50mV點(diǎn)位范圍檢測(cè)。

1.4 特異性分析

以金黃色葡萄球菌為陽(yáng)性對(duì)照，以沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7等標(biāo)準(zhǔn)菌株作為特異性檢測(cè)菌株，以PSBT做空白對(duì)照，從而驗(yàn)證方法的特異性。

1.5 靈敏度分析

將金黃色葡萄球菌滅活菌液稀釋為1.0×104、1.0×105、1.0×106、1.0×107、1.0×108CFU/mL等5個(gè)濃度梯度，以PBST作為陰性對(duì)照，通過(guò)檢測(cè)電導(dǎo)信號(hào)確定方法的檢測(cè)靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)方法特異性

使用微間隙陣列電極傳感器檢測(cè)了8種致病菌，以測(cè)試該方法的特異性，不同菌種檢測(cè)的電導(dǎo)值變化見圖1。由圖1可見，只有加入金黃色葡萄球菌懸液的傳感器電導(dǎo)率變化明顯，空白對(duì)照和非目標(biāo)菌株的電導(dǎo)率變化不明顯，說(shuō)明該方法對(duì)金黃色葡萄球菌的特異性較高，且與其他菌株無(wú)交叉反應(yīng)。

圖1 不同菌懸液的電導(dǎo)值變化

2.2 檢測(cè)方法靈敏度

金黃色葡萄球菌濃度在104～108CFU/mL范圍內(nèi)變化時(shí)，其LSV響應(yīng)曲線見圖2。由圖2可知，菌液濃度越高，其電導(dǎo)值越大，該方法的檢測(cè)限為104CFU/mL。同時(shí)，金黃色葡萄球菌濃度越高，檢測(cè)到的電導(dǎo)率越大，二者之間呈線性關(guān)系（如圖3），其線性方程為：電導(dǎo)率（pS）=1169LogC（CFU·mL-1）-1141，R2=0.947。

圖2 不同金黃色葡萄球菌濃度下LSV響應(yīng)曲線

圖3 不同金黃色葡萄球菌濃度下微間隙陣列電極電導(dǎo)率的線性曲線

3 結(jié)論

本文采用微間隙陣列電極作為基礎(chǔ)電極，結(jié)合雙抗夾心免疫反應(yīng)構(gòu)建了電化學(xué)免疫傳感器，通過(guò)電化學(xué)分析，實(shí)現(xiàn)了對(duì)金黃色葡萄球菌的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法特異性良好，檢測(cè)靈敏度可達(dá)104CFU/mL，檢測(cè)電導(dǎo)率和菌濃度呈正相關(guān)，線性相關(guān)系數(shù)為0.947。本方法利用堿性磷酸酶的催化作用，使銀離子還原成銀單質(zhì)沉淀在電極之間，相鄰的電極被導(dǎo)通從而在有外加電壓時(shí)產(chǎn)生電流信號(hào)，電化學(xué)信號(hào)放大系統(tǒng)具有靈敏度高、高效、背景干擾低等優(yōu)點(diǎn)。免疫反應(yīng)采用雙抗夾心法，包被抗體為多克隆抗體，能有效捕獲目標(biāo)菌株，識(shí)別抗體為單克隆抗體，有效提高了該方法的特異性。該方法將電化學(xué)生物傳感技術(shù)與免疫學(xué)方法有效結(jié)合，可以將封閉好的芯片真空干燥后密閉保存，現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)只需加增菌液的后續(xù)步驟，從而縮短了檢測(cè)時(shí)間，可以滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需要。