■姚金明 陳秀梅 劉明哲 牛小天 單曉楓 王桂芹

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130118）

蝦青素又名蝦黃素、蝦黃質(zhì)、龍蝦殼色素，是一種端基為酮基的類胡蘿卜素，不僅具有抗氧化、增強(qiáng)免疫力、提高繁殖力等生理功能，目前作為著色劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖上被廣泛應(yīng)用[1-2]。這是因為動物體內(nèi)缺乏相關(guān)酶系自身不能合成蝦青素（海產(chǎn)動物也不例外)[3]。但是，研究發(fā)現(xiàn)一些水產(chǎn)動物體內(nèi)均含有豐富的蝦青素，其主要來源是通過攝食含蝦青素的藻類或其他微生物，從而在體內(nèi)積聚蝦青素。目前在人工集約化養(yǎng)殖條件下，水產(chǎn)動物不能從外界獲取足夠的蝦青素，導(dǎo)致體色異常普遍變淺[4]。而蝦青素進(jìn)入動物體后可以不經(jīng)修飾或轉(zhuǎn)化而直接貯存在組織中，并可與肌紅蛋白非特異性結(jié)合。因此，與其他類胡蘿卜素相比蝦青素具有較好的著色效果[5]。已有的研究表明，在家禽飼料中添加蝦青素不僅可以提高生長性能、降低料肉比，更可富集在禽蛋、禽肉中，改善其色澤和風(fēng)味，進(jìn)而增加其營養(yǎng)價值和保健功能[6-8]。在水產(chǎn)動物方面，近年來國內(nèi)外的學(xué)者已經(jīng)在七彩神仙魚(Symphy-sodon aequifasciata)[9]、血鸚鵡(Cichlasoma var.)[10]、錦鯉(Cyprinus carpio)[11]及虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[12]等物種上開展研究，這些研究結(jié)果均表明在飼料中外源添加蝦青素均有促進(jìn)魚類的生長、改善體色的效用。

大鱗副泥鰍（Paramisgurnus dabryanus）隸屬于鯉形目（Cypriniformes）、鰍科（Cobitidae）、花鰍亞科（Co-bitidae），屬于副泥鰍屬（Paramisgurnus），是一種常見的小型淡水經(jīng)濟(jì)魚類，在我國自南至北均有分布[13]。作為近幾年東亞地區(qū)養(yǎng)殖需求非要高的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一，市場潛力巨大。但受養(yǎng)殖密度過大和高效配合飼料匱乏的限制，大鱗副泥鰍生長速度緩慢、體色異常，嚴(yán)重地降低了產(chǎn)品品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)效益。而且關(guān)于蝦青素在大鱗副泥鰍養(yǎng)殖中的應(yīng)用，目前在生產(chǎn)上幾乎是空白。因此，本試驗通過外源添加蝦青素初步探討蝦青素對大鱗副泥鰍生長及體色的影響，以期為蝦青素作為增色劑的開發(fā)利用提供相關(guān)理論依據(jù)，為蝦青素在大鱗副泥鰍健康養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料的制備

蝦青素購于西安澤邦生物科技有限公司（提取于雨生紅球藻，濃度為2%），在基礎(chǔ)飼料中添加不同水平（0、50、100、150、200 mg/kg）蝦青素配成五種配合飼料。飼料原料粉碎后經(jīng)0.246 mm（60 目）篩，按飼料配方稱重，并加工成直徑為1.2 mm的顆粒狀飼料，于室外晾曬，晾干后放置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。飼料配方及營養(yǎng)水平見表1。

1.2 試驗魚及飼養(yǎng)管理

大鱗副泥鰍幼魚購買于吉林省2814 養(yǎng)殖場，飼養(yǎng)試驗在室內(nèi)單循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行，在試驗前飼養(yǎng)于水族箱中15 d。飽食投喂對照組飼料使其適應(yīng)試驗飼養(yǎng)環(huán)境和飼料，然后挑選身體健康、體型及規(guī)格一致，體重為(3.01±0.10) g的大鱗副泥鰍450尾，隨機(jī)分成5 組，每組3 個重復(fù)，每個重復(fù)30 尾。水族箱水溫設(shè)定23～25 ℃，溶解氧大于5 mg/l，pH 值7.1±0.1。每日飽食投喂兩次（9：00、16：00），1 h 后檢查水族箱內(nèi)殘餌情況，用虹吸法吸出沉積殘餌，并根據(jù)殘餌量調(diào)整投喂量。飼養(yǎng)試驗為期8周。

1.3 樣品的收集與測定

1.3.1 樣品的收集

表1 飼料配方及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

8 周養(yǎng)殖結(jié)束后，禁食24 h，稱量體重后，冰上解剖取頭、鰭、肝胰臟、腸道、皮膚及肌肉，-80 ℃冰箱保存待測。

1.3.2 生長指標(biāo)測定

平均增重率(WG，%)=(Wt-W0)/W0×100

特定生長率(SGR，%/d)=(ln Wt-ln W0)/t×100

式中：Wt、W0——分別為初始和終末魚體重（g）；

t——試驗時間（d）。

1.3.3 類胡蘿卜素含量的測定

將大鱗副泥鰍頭、鰭、皮膚和肌肉組織放在吸水紙上，準(zhǔn)確稱取質(zhì)量后置于10 ml 離心管中（精確到0.01 g）。向離心管中各加3 ml丙酮，放入勻質(zhì)器中勻漿6 s間隔1 min 勻漿3次后取出；用錫紙包裹密封于4 ℃保存24 h后，以8 000 r/min離心10 min。離心后分別將各樣品在具塞試管中稀釋定容到6 ml，將所得的組織色素萃取液分別置于1 cm 比色皿中，以丙酮為空白對照管（加蓋防止丙酮揮發(fā)），在紫外-可見分光光度計380～620 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，找出最大吸收峰處的波長，在該波長（448 nm）下測定各組提取液的吸光值。類胡蘿卜素含量的計算公式如下所示：

類胡蘿卜素含量（F，mg/kg）=（A×K×V）/（E×G）

式中：A——吸光值；

K——常數(shù)（104）；

V——提取液體積（ml）；

E——吸光系數(shù)（2 500）；

G——樣品濕重（g）。

1.3.4 酪氨酸酶（tyrosinase，Tyr）的測定

將大鱗副泥鰍肝臟、腸道、皮膚和肌肉組織解凍、剪碎并稱其重量（精準(zhǔn)到0.01 g），加入4 ℃的生理鹽水稀釋10倍，勻漿5 min，4 ℃離心10 min(5 000 r/min)，取上清液，置于離心管中，4 ℃保存，并在24 h 內(nèi)測定完畢。

Tyr 的含量采用ELISA 檢測試劑盒（上海源葉生物科技有限公司）測定，試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗。依次往預(yù)先包被Tyr抗體的包被微孔中加入樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育、清洗、底物TMB 顯色。顏色的深淺和樣品中的Tyr 呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm 波長下測定吸光度（OD值），并計算樣品濃度。

1.4 統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)采用SPSS（20.0）軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，若方差分析顯著，進(jìn)一步進(jìn)行Duncan's 法多重比較，分析組間差異顯著性，顯著水平設(shè)定P＜0.05，試驗數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 飼料蝦青素添加水平對大鱗副泥鰍生長的影響(見表2)

表2 飼料中蝦青素水平對大鱗副泥鰍生長的影響

由表2 可見，蝦青素對大鱗副泥鰍生長有影響。大鱗副泥鰍的平均增重率和特定生長率隨蝦青素的添加水平提高而呈現(xiàn)上升的趨勢，當(dāng)蝦青素的添加水平為50～200 mg/kg 時顯著高于對照組（P＜0.05），且在蝦青素的添加量為100 mg/kg時達(dá)最高水平（P＜0.05）。

2.2 飼料蝦青素添加水平對大鱗副泥鰍各組織類胡蘿卜素含量的影響(見圖1)

由圖1可見，蝦青素對大鱗副泥鰍各組織總類胡蘿卜素含量有影響。大鱗副泥鰍頭、鰭、皮膚和肌肉類胡蘿卜素含量隨蝦青素的添加水平提高呈現(xiàn)上升的趨勢，當(dāng)蝦青素的添加水平為100～200 mg/kg時，均顯著高于對照組（P＜0.05），其中當(dāng)蝦青素的添加水平為150 mg/kg和200 mg/kg時達(dá)到最高水平（P＜0.05）。

2.3 飼料蝦青素添加水平對大鱗副泥鰍各組織Tyr含量的影響（見圖2）

由圖2 可見，蝦青素對大鱗副泥鰍各組織Tyr 含量有影響。大鱗副泥鰍的各組織Tyr含量隨蝦青素的添加水平提高呈現(xiàn)下降的趨勢：當(dāng)蝦青素的添加水平為150～200 mg/kg 時，肝臟Tyr 含量顯著低于對照組（P＜0.05）；當(dāng)蝦青素的添加水平為50～200 mg/kg 時，肌肉和皮膚Tyr 含量顯著低于對照組（P＜0.05）；但腸道中各組的Tyr含量差異不顯著。

3 討論

3.1 飼料蝦青素添加水平對大鱗副泥鰍生長的影響

作為飼料添加劑，蝦青素具有明顯的促生長作用，適宜添加后可使飼喂水產(chǎn)動物達(dá)到最佳生長狀態(tài)。在本試驗條件下，隨著蝦青素添加水平的提高，大鱗副泥鰍的平均增重率和特定生長率均呈現(xiàn)上升的趨勢。當(dāng)蝦青素的添加量為50～200 mg/kg時，大鱗副泥鰍的平均增重率和特定生長率顯著高于對照組。類似的研究結(jié)果有很多，黃璞祎等[9]對七彩神仙魚的研究結(jié)果表明，以生長需要和養(yǎng)殖成本為評價指標(biāo)，蝦青素適宜的添加水平為50 mg/kg。孫劉娟等[10]對血鸚鵡的研究結(jié)果表明，2‰和3‰蝦青素添加量可獲得較好的生長效果。崔培等[11]對紅白錦鯉的研究結(jié)果則表明飼料中蝦青素添加量為700 mg/kg 時，體質(zhì)量增長率、蛋白質(zhì)效率顯著高于對照組。此外，其他水產(chǎn)動物如斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）[14]、凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）[15]、南美白對蝦幼蝦（Penaeus vannamei Boone）[16]以及仿刺參幼參（Apos-tichopus japonicus）[17]上的研究結(jié)果同樣證明蝦青素對水產(chǎn)動物有一定的促生長作用。以上研究均驗證了蝦青素的促生長作用，但Harpaz等[18]發(fā)現(xiàn)飼料中添加蝦青素不能顯著提高紅螯螯蝦(Chrtax quadricarina-tus)的生長率及成活率。究其原因，這可能是因代謝機(jī)制的差異，蝦青素添加量沒有達(dá)到其所需量。這也表明蝦青素促生長作用可能存在濃度依賴性，而且蝦青素促生長作用的具體調(diào)控機(jī)制仍需深入研究。

圖1 飼料蝦青素添加水平對大鱗副泥鰍各組織類胡蘿卜素含量的影響

3.2 飼料蝦青素添加水平對大鱗副泥鰍體色的影響

體色是魚類一種較為獨特的表型性狀，在人工養(yǎng)殖過程中，某些養(yǎng)殖品種蝦青素攝食量達(dá)不到需求，體內(nèi)積累不夠，導(dǎo)致其體色不夠紅潤，影響商品價值。因此，許多研究者以蝦青素作為添加劑，來改善水產(chǎn)動物體色。牟文燕等[19]和張曉紅等[20]研究結(jié)果均證明血鸚鵡在攝食添加蝦青素的飼料后，其體內(nèi)色素沉積量明顯增加，增色效果顯著，并得出蝦青素適宜添加量為500 mg/kg。類似地，李小兵等[21]在對金曼龍魚（Trichogaster microlepis）的研究結(jié)果表明：飼料中添加蝦青素后，其色素主要沉積在魚鰭、魚皮和魚鱗表面，且添加量為100 mg/kg時，其著色效果最佳。同樣，本試驗研究結(jié)果表明大鱗副泥鰍的各組織類胡蘿卜素含量隨蝦青素的添加水平提高呈現(xiàn)上升的趨勢，當(dāng)蝦青素的添加水平為100～200 mg/kg時顯著高于對照組，且當(dāng)蝦青素的添加水平為150 mg/kg和200 mg/kg時達(dá)到最高水平。這說明體色的改善存在濃度依賴效果，在紅羅非魚（Oreochromis mossambicus）體色方面的研究亦證明了這一點：蝦青素添加量為400 mg/kg 時紅羅非魚皮膚、鰭、肌肉、眼球和腮中類胡蘿卜素含量較對照組顯著提高，體色明顯改善；800 mg/kg 時，粉白紅羅非魚和黑斑紅羅非魚腮部類胡蘿卜素沉積量較對照組顯著提高[22]。

深入分析，魚類之所以呈現(xiàn)不同的體色，是因為魚體內(nèi)存在著各種不同的色素細(xì)胞（黑色素細(xì)胞、黃色素細(xì)胞、紅色素細(xì)胞、虹彩細(xì)胞、白色素細(xì)胞等），隨著色素細(xì)胞內(nèi)色素顆粒的移動導(dǎo)致體色的變化（不同的陰暗和著色情況），同時受神經(jīng)及內(nèi)分泌系統(tǒng)（激素）的調(diào)控[23]。目前在眾多色素細(xì)胞中黑色素細(xì)胞是當(dāng)前國內(nèi)外體色研究最為廣泛而深入的，黑色素細(xì)胞主要分泌真黑素和褐黑色素[24]，其中酪氨酸酶（Tyr）對真黑色素的生成發(fā)揮關(guān)鍵性作用。有研究報道，通常魚的背部表面Tyr 的含量和活性較腹面高，體色也較深[25]。本試驗條件下，大鱗副泥鰍的肝、肌肉和皮膚組織的Tyr含量隨蝦青素的添加水平提高呈現(xiàn)下降的趨勢。這表明飼料中添加蝦青素可通過減少Tyr 含量，進(jìn)而減少黑色素的生成，提亮魚體體色。但是，也有一些研究結(jié)果表明體色淡的魚類體內(nèi)酪氨酸酶也具有較高活性（但黑素細(xì)胞中沒有黑色素），分析酪氨酸酶可能存在多種形式，部分處于抑制狀態(tài)[26]。但關(guān)于蝦青素如何具體調(diào)控大鱗副泥鰍體色的機(jī)制仍不清楚?？傊?，豐富多彩的魚類體色是長期自然選擇的結(jié)果，涉及遺傳學(xué)、進(jìn)化生物學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)。因此，要想探明魚體體色變異還需借用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，進(jìn)一步明確魚類體色變異的分子機(jī)制，在此基礎(chǔ)上營養(yǎng)調(diào)控才能發(fā)揮最大的功用。

圖2 飼料蝦青素添加水平對大鱗副泥鰍各組織Tyr含量的影響

4 結(jié)論

本試驗條件下，在大鱗副泥鰍飼料中添加100～200 mg/kg蝦青素可顯著提高大鱗副泥鰍各組織類胡蘿卜素含量，降低Tyr含量，進(jìn)而有效改善大鱗副泥鰍體色。