胡安古麗·努爾別克 ， 賽福丁·阿不拉 ， 那爾胡蘭·再肯 ， 布合麗倩穆·依明 ，馬凱琪 ， 陳 凱 ， 陳雪珂 ， 德力拜爾

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 新疆 烏魯木齊 830052)

犢牛腹瀉是危害犢牛的常見疾病之一，該病一年四季均可發(fā)生，尤其哺乳期的犢牛更容易發(fā)生腹瀉，且發(fā)病率高，嚴(yán)重地影響奶牛產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，被稱為新生犢牛的殺手[1-3]。而導(dǎo)致犢牛腹瀉的原因很多，其中大腸桿菌是犢牛腹瀉的主要原因之一。大腸桿菌作為腸道菌群的重要組成部分，一般是非致病的，但是一些特殊血清型的大腸桿菌可導(dǎo)致家畜的腹瀉及敗血，早在 1955年Scholfield等就發(fā)現(xiàn)某些大腸桿菌對家畜具有致病性[4]。1967年 Kolher、Smit等指出，產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(EnterotoxigenicEscherichia.coli,ETEC)是引起幼畜腹瀉的主要致病菌[5]。Levine和Osel分別在1987年和1992年證明ETEC是導(dǎo)致幼畜腹瀉的重要原因[6-7]。隨著國內(nèi)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，致病性大腸桿菌對我國畜牧業(yè)的損害也日益明顯[8]。高睿等[9]在2008年對陜西部分地區(qū)腹瀉犢牛進(jìn)行病原學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)ETEC為主要致病菌。方光遠(yuǎn)等在2014年通過分析南京地區(qū)奶牛場犢牛腹瀉原因，證明該地區(qū)犢牛腹瀉是由大腸桿菌引起的[10]。

最近的研究普遍認(rèn)為，大腸桿菌容易產(chǎn)生耐藥性且變化快，耐藥頻率也隨著時間的推移顯著提升，耐藥譜范圍變得更加廣泛，對常用的抗生素已經(jīng)廣譜耐藥[11]。天然藥物具有較好的抑制犢牛腹瀉致病菌的作用，何博等[12]在中國知網(wǎng)進(jìn)行檢索發(fā)現(xiàn)，關(guān)于犢牛腹瀉的論文就有1 548篇，其中應(yīng)用中藥治療犢牛腹瀉的有64篇，絕大部分都取得了一定的療效。Subhadra等[13]使用石龍尾屬甲醇提取物對抗志賀菌和抗酸活性進(jìn)行研究，證明100 mg/kg·bw的最低劑量對大鼠腹瀉模型治療效果比洛哌丁胺明顯(P<0.01)，被證明是一種抗菌性的止瀉劑。本試驗(yàn)以中藥的抗菌、抗毒素、抗病毒、補(bǔ)充營養(yǎng)、免疫調(diào)節(jié)、提高生產(chǎn)性能等作用為突破口，研究11種中藥(大黃、石榴花、紅花、阿魏、小檗實(shí)、沒食子、駱駝縫子、石榴皮、檉柳實(shí)、黃連和甘草)對致犢牛腹瀉大腸桿菌體外抑菌作用，為治療犢牛腹瀉大腸桿菌病提供參考和依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 中藥 大黃、石榴花、紅花、阿魏、小檗實(shí)、沒食子、駱駝蓬子、石榴皮、檉柳實(shí)、黃連、甘草，以上藥物均購自新疆維吾爾自治區(qū)民族醫(yī)院。

1.2 培養(yǎng)基 MH肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基等購自新疆鼎楓生物科技有限公司。

1.3 菌種 致犢牛腹瀉大腸桿菌由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院中獸醫(yī)藥研究室提供。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 中藥提取液的制備 水提醇沉法：將駱駝蓬子、沒食子、小檗實(shí)等11種中藥材，干燥、粉碎，稱取30 g，每次加10倍水煎煮2 h、重復(fù)3次，過濾，濾液減壓濃縮至75 mL，加入95%乙醇后總體含量達(dá)到70%，攪拌后置于4 ℃冰箱過夜，3 000 r/min離心5 min，取上清液減壓回收乙醇后，再加95%乙醇使總體含量達(dá)到80%以上，然后再置于4 ℃冰箱過夜，過濾，減壓回收乙醇，調(diào)pH值到7.0±0.2，成原液濃縮1 g/mL，用無菌過濾器過濾藥液，分裝于無菌管中，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹14]。

1.4.2 大腸桿菌懸液的制備 活化后的大腸桿菌接種于營養(yǎng)瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)18-24 h后，挑取單菌落接種至肉湯中，37 ℃培養(yǎng)18-24 h，平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，用無菌生理鹽水稀釋至103～107CFU/mL備用。

1.4.3 體外抑菌試驗(yàn) 采用打孔給藥法：滅菌棉簽將稀釋的菌液均勻涂抹營養(yǎng)瓊脂平板，用6 mm無菌打孔、封底。每孔加入不同的藥液100 μL，每種藥物重復(fù)3次，置于恒溫培養(yǎng)箱中在37 ℃條件下，培養(yǎng)18-24 h，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。

采用牛津杯法：將牛津杯放置已鋪好菌的瓊脂平皿上，每平皿放6個杯，每個杯加入100 μL的藥液，每種藥物重復(fù)3次，37 ℃培養(yǎng)18-24 h，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。

判斷標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑≥20 mm為極敏，抑菌圈直徑在15～19 mm為高敏，抑菌圈直徑在10～14 mm為中敏，抑菌圈直徑<10 mm為低敏，無抑菌圈為耐藥[15]。

1.4.4 MIC和MBC的測定 最低抑菌濃度(MIC)的測定：取裝有滅菌肉湯培養(yǎng)基1 mL的試管12支，第1支試管加入滅菌處理的藥液1 mL(1 g/mL)，混勻后吸取1 mL置第2試管，以此類推，直到第9管吸取1 mL棄去，第10管只加菌不加藥物作為對照管，第11管只加肉湯培養(yǎng)，第12管中加受試藥液1 mL，然后取10 μL的供試菌分別加入1～12管中，搖勻后放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，并觀察結(jié)果。

最低殺菌濃度(MBC)的測定：所有無細(xì)菌生長的試管中取20 μL的肉湯，劃線接種于瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)18 h，平板上菌落生長數(shù)小于3個對應(yīng)的最低藥物濃度作為MBC[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 11種中藥提取物對致犢牛腹瀉大腸桿菌敏感性的測定 結(jié)果見表1。從表1結(jié)果可見，牛津杯法的結(jié)果和瓊脂平板打孔法的結(jié)果基本一致，但各種中藥提取物對致犢牛腹瀉大腸桿菌的抑菌效果各不相同，石榴花、紅花、阿魏、檉柳實(shí)和甘草對致犢牛腹瀉大腸桿菌基本無抑菌效果，大黃的抑菌效果較低，小檗實(shí)和黃連對致犢牛腹瀉大腸桿菌抑菌效果為高度敏感，其中駱駝蓬子和沒食子的抑菌效果較明顯，抑菌圈達(dá)到25.63 mm、21.89 mm，抑菌效果最好。

2.3 11種中藥提取物(MIC)和(MBC)的測定 由表2可知，11種不同中藥提取物對致犢牛腹瀉大腸桿菌抑菌活性不同。駱駝蓬子和沒食子對致犢牛腹瀉大腸桿菌的抑制效果較好，MIC值3.91 mg/mL、31.25 mg/mL，MBC值為7.812 5 mg/mL、62.5 mg/mL；小檗實(shí)和黃連MIC值均為62.50 mg/mL，MBC值均125 mg/mL；石榴皮和大黃MIC值均為125 mg/mL，MBC值均250 mg/mL，結(jié)果見表2。

表1 11中藥的提取物對致犢牛腹瀉大腸桿菌的打孔法測定

++++: 極敏; +++:高敏; ++:中敏; +:低敏; -:無效果
抑菌圈直徑包括孔徑直徑。抑菌圈直徑包括牛津杯直徑。

表2 6中藥提取物對大腸桿菌的MIC和MBC測定

3 討論

犢牛腹瀉大腸桿菌病是奶牛生產(chǎn)及畜牧業(yè)中經(jīng)濟(jì)損失較高的最常見的一種病，發(fā)病率高，且血清型多，不同血清型對藥物的敏感性不一致。本試驗(yàn)對11種中藥提取液的體外抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，駱駝蓬子、沒食子對犢牛腹瀉致病菌有較好的抑菌作用，黃連、石榴皮、小檗實(shí)和大黃的抑菌效果次之，而紅花、阿魏、石榴花、檉柳實(shí)、甘草等5種中藥的提取物對致犢牛腹瀉大腸桿菌沒有表現(xiàn)出抑菌效果。向雙云等對黃芩、黃連、黃柏、魚腥草等8 種中草藥檢測對大腸桿菌的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃連、魚腥草、五味子和艾草對大腸桿菌的抑菌效果最強(qiáng)，與本試驗(yàn)結(jié)果相似，出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能與藥物成分有關(guān)，黃連的抑菌成分一般是小檗堿，具有廣泛的抑菌作用[17]。南蘋瑤等檢測14味中藥乙醇提取物體外抗大腸桿菌活性，發(fā)現(xiàn)70%乙醇提取獲得的丁香、黃連、山楂、黃柏和大黃提取物對大腸埃希菌抑菌直徑為21.5mm、23.5mm、23.0mm、21.5mm、21.5mm，大黃的抑菌效果優(yōu)于本試驗(yàn)中大黃對犢牛腹瀉大腸桿菌的抑菌效果[18]。常婧等研究表明，甘草為原料用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇和水等不同極性的溶劑進(jìn)行提取，以金色葡萄球菌和大腸桿菌進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這不同極性成分的物質(zhì)對兩種菌均有一定的抑菌效果，這與本試驗(yàn)結(jié)果不符[19]。造成這一系列差異的原因可能與藥物來源、質(zhì)量、提取方法、大腸桿菌血型及藥物濃度有關(guān)。

此外，本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)駱駝蓬子對致犢牛腹瀉大腸桿菌有較好的抑菌作用，抑菌直徑及MBC分別為：25.63 mm、7.81 mg/mL。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道復(fù)方駱駝蓬子油對綠膿桿菌、大腸桿菌、金色葡萄球菌有一定的抑菌作用[20]。其抑菌作用可能與駱駝蓬的β-Carboline骨架有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。