張冀原， 陳 羽， 林 涵， 何 晴， 徐 威

(沈陽藥科大學(xué)，遼寧 沈陽 110016)

血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是由二硫鍵連接的同源二聚體糖蛋白，主要通過特異性結(jié)合血管內(nèi)皮生長因子受體酪氨酸激酶，被激活的酪氨酸激酶接著激活下游信號(hào)分子，比如磷脂酶C2Y、蛋白激酶C等，最終將信號(hào)傳至細(xì)胞核內(nèi)，通過特定的基因片段進(jìn)行表達(dá)[1]。文獻(xiàn)報(bào)道，血管內(nèi)皮生長因子與腫瘤生長有著千絲萬縷的聯(lián)系[2]。在腫瘤的病理診斷中，常見血管內(nèi)皮生長因子的廣泛表達(dá)[3-4]。因此，以血管內(nèi)皮生長因子及其相應(yīng)的受體作為靶點(diǎn)來治療癌癥是當(dāng)今藥物研發(fā)的熱門方向之一。單鏈抗體是由抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)通過一段連接肽構(gòu)成的重組蛋白，具有抗原結(jié)合能力。與傳統(tǒng)的單克隆抗體相比，組織穿透力更強(qiáng)，人體發(fā)生超敏反應(yīng)的概率更低[5]。單鏈抗體不需要糖基化修飾即可在大腸埃希菌中直接進(jìn)行大量制備，為臨床應(yīng)用提供了必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。借助大腸埃希菌表達(dá)非自身蛋白是世界通用的蛋白生產(chǎn)技術(shù)[6-8]，但如何高效表達(dá)小分子抗體卻是擺在科研工作者面前的一道難題。本研究以血管內(nèi)皮生長因子單鏈抗體為研究對象，考察不同培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對血管內(nèi)皮生長因子單鏈抗體表達(dá)量的影響，為將該重組大腸埃希菌在發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)大再培養(yǎng)提供前期研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 工程菌 工程菌R22-4，由質(zhì)粒pET22b(+)-anti-VEGF-scFv(含His標(biāo)簽)轉(zhuǎn)化EscherichiacoliBL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞獲得，本課題組保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 LB液體培養(yǎng)基；2×YT液體培養(yǎng)基(g/L，pH 7.0)：胰蛋白胨16，酵母提取物10，NaCl 5；TB液體培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨12，酵母提取物24，甘油4，KH2PO42，K2HPO412；SOB液體培養(yǎng)基(g/L，pH 7.0)：胰蛋白胨20，酵母提取物5，NaCl 0.5，KCl 0.19，MgCl20.95；M9液體培養(yǎng)基(g/L，pH 7.0)：Na2HPO4·12H2O 15，KH2PO43，NaCl 0.5，NH4Cl 1，甘油3，CaCl20.11，MgSO40.12；微量元素(g/L)：FeCl3·6H2O 13.5，CaCl22.2，MnCl2·4H2O 1.97，ZnSO4·7H2O 2.87，CoCl2·6H2O 0.47，CuCl20.27，NiCl20.26，Na2MoO4·2H2O 0.556，Na2SeO30.35，H3BO30.12[9]。酵母提取物、胰蛋白胨購自O(shè)xiod公司；蛋白胨、酵母膏、玉米漿、牛肉膏等購自天津冠前化工經(jīng)銷部；甘油、葡萄糖、蔗糖、KH2PO4、K2HPO4、NaCl等購自北京化工廠；BugBuster Master Mix蛋白抽提液、脫氧核糖核酸酶I(DNaseⅠ)購自Novagen公司；PBST洗滌液、PBS溶液、牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum，BSA)購自上海生工生物工程有限公司；血管內(nèi)皮生長因子單鏈抗體、Human VEGF、抗His抗體(HRP標(biāo)記)、IPTG、3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine，TMB)等購自Sigma公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備 電子天平(BS223S，德國Sartorius公司)，恒溫振蕩器(THZ-312，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，臺(tái)式高速離心機(jī)(KDC-16H，安徽中科中佳科技有限公司)，可見光分光光度計(jì)(VIS-723，上海第三分析儀器廠)，酶標(biāo)儀(ELx800uv，美國BIO-TEK公司)，超凈工作臺(tái)(AIRTECH，蘇凈集團(tuán)安泰公司)，pH計(jì)(PB-10，德國Sartorius公司)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 在酶標(biāo)板中加入用PBS溶液稀釋至1 μg/mL的Human VEGF溶液100 μL，4 ℃包被過夜；棄去包被液，PBST洗3次，拍干，每孔加入含2% BSA的PBS溶液200 μL，用新封板膠紙封住反應(yīng)孔，37 ℃孵育120 min；PBST洗3次，拍干，每孔加入100 μL不同濃度血管內(nèi)皮生長因子單鏈抗體稀釋液(用PBS溶液稀釋至62.5、125、250、500、1 000 ng/mL)，置于恒溫振蕩箱，37 ℃振蕩2 h；PBST洗3次，拍干，按1∶4 000的比例，用含1%BSA的PBS溶液稀釋抗His抗體(HRP標(biāo)記)，每孔加入酶標(biāo)抗體100 μL，37 ℃振蕩2 h；PBST洗3次，再用PBS洗1次，拍干，每孔加入3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺100 μL，37 ℃避光孵育15 min；再加入50 μL的1 mol/L HCl終止反應(yīng)，450 nm酶標(biāo)儀檢測結(jié)果。以濃度對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以O(shè)D450為縱坐標(biāo)，制作血管內(nèi)皮生長因子單鏈抗體濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 培養(yǎng)基類型的篩選 將工程菌R22-4以1%接種量接種至LB種子培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min過夜培養(yǎng)至OD600值為3.5(菌液稀釋10倍后檢測，直接檢測值為0.35)，次日以6%接種量分別轉(zhuǎn)種至LB、2×YT、TB、SOB和M9 等5種不同液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.8時(shí)，加入0.5 mmol/L IPTG，降溫至30 ℃，220 r/min誘導(dǎo)8 h。誘導(dǎo)結(jié)束后，測定菌液的OD600值，將培養(yǎng)后的菌液于8 000 r/min離心8 min，棄上清液；取菌體0.1 g，依次加入600 μL BugBuster Master Mix蛋白抽提液、1 μL DNase Ⅰ(12.5 U/μL)中，充分混勻，將混合液置于脫色搖床上，振蕩30 min使其充分裂解。于4 ℃、15 000 r/min離心10 min；取上清液，15 000 r/min再次離心10 min后，收集上清，用上清液代替血管內(nèi)皮生長因子單鏈抗體稀釋液進(jìn)行ELISA檢測。根據(jù)血管內(nèi)皮生長因子單鏈抗體濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出目的蛋白表達(dá)量，進(jìn)而確定適宜的培養(yǎng)基類型。

1.2.3 培養(yǎng)基成分單因素篩選 分別添加不同碳源(葡萄糖、甘油、蔗糖) 、不同氮源(用蛋白胨、酪蛋白胨、Hy-Soy、N-Z-Amine代替胰蛋白胨；用酵母膏、玉米漿、牛肉膏、Hy-Yest代替酵母提取物)、不同無機(jī)鹽、微量元素、維生素到培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)及發(fā)酵培養(yǎng)條件不變，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照，利用ELISA法檢測抗體表達(dá)量，確定有利于目的蛋白表達(dá)的培養(yǎng)基成分[10]。

1.2.4 培養(yǎng)基優(yōu)化研究 將具有正效作用的培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化組合，設(shè)計(jì)出不同復(fù)合培養(yǎng)基并用于工程菌R22-4表達(dá)，確定最優(yōu)培養(yǎng)基。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在酶標(biāo)板中分別加入不同濃度(62.5、125、250、500、1 000 ng/mL)血管內(nèi)皮生長因子單鏈抗體，以濃度對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以O(shè)D450為縱坐標(biāo)，制作血管內(nèi)皮生長因子單鏈抗體濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖 1。由圖 1 可以看出，當(dāng)血管內(nèi)皮生長因子單鏈抗體質(zhì)量濃度在62.5～1 000 ng/mL范圍內(nèi)，抗體濃度與吸光度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)R2= 0.999 1。

圖1 血管內(nèi)皮生長因子單鏈抗體標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of anti-VEGF-scFv

2.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的篩選

利用LB、2×YT、TB、SOB和M9等5種不同液體培養(yǎng)基表達(dá)目的蛋白，檢測發(fā)酵液的濕菌重和單位濕重菌體目標(biāo)抗體的含量，計(jì)算出蛋白表達(dá)量[4]，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，工程菌R22-4在2×YT培養(yǎng)基中生長最好(10.52 g/L)，目的蛋白表達(dá)量最高(3.95 mg/L)，最終選擇2×YT培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

圖2 培養(yǎng)基對目的蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Influence of culture media on the target protein expressionv

2.3 培養(yǎng)基成分的篩選

2.3.1 碳源的篩選 在確定2×YT培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加3種不同的碳源(葡萄糖、甘油和蔗糖)，添加的碳源質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為0.5%，菌體經(jīng)發(fā)酵后檢測，結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，當(dāng)加入碳源葡萄糖后，菌體生長最好(14.38 g/L)，目的蛋白表達(dá)量最高(5.91 mg/L)，故選擇葡萄糖作為碳源。

圖3 碳源對目的蛋白的表達(dá)的影響Fig.3 Influence of carbon source on the target protein expression

2.3.2 氮源的篩選 在選定葡萄糖初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%，保持基礎(chǔ)培養(yǎng)基其他成分不變的條件下，選取質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.6%的蛋白胨、酪蛋白胨、Hy-Soy、N-Z-Amine代替胰蛋白胨；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%的酵母膏、玉米漿、牛肉膏、Hy-Yest代替酵母提取物作為培養(yǎng)基氮源[11]，結(jié)果見圖4。從圖4可以看出，采用不同氮源，菌體生長和目的蛋白表達(dá)的差異不明顯，但加入酪蛋白胨和玉米漿卻對目的蛋白表達(dá)量有促進(jìn)作用，故作為替代氮源。

圖4 氮源對目的蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Influence of nitrogen source on the target protein expression

2.3.3 無機(jī)鹽、微量元素和維生素的篩選 發(fā)酵過程中加入適量的無機(jī)鹽、微量元素、維生素，會(huì)對目的蛋白表達(dá)量產(chǎn)生影響。在搖瓶實(shí)驗(yàn)中，以2×YT培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別單獨(dú)添加3種常見的原核細(xì)胞無機(jī)鹽溶液(無機(jī)鹽①：KH2PO4∶K2HPO4∶NaCl=1∶1.2∶2；無機(jī)鹽②：KH2PO4∶K2HPO4∶NaCl=1∶1.2∶4；無機(jī)鹽③：KH2PO4∶K2HPO4∶NaCl=1∶1.2∶8)、微量元素和維生素B1，結(jié)果見圖5。從圖5可以看出，加入無機(jī)鹽、微量元素和維生素后，菌體生長和目的蛋白表達(dá)均有所提高，其中無機(jī)鹽②、微量元素和VB1變化相對顯著，故選擇它們作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的微量添加物。

圖5 無機(jī)鹽、微量元素、維生素對目的 蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Influence of inorganic salt,trace elements, vitamins on the target protein expression

2.4 誘導(dǎo)條件的選擇

2.4.1 最佳誘導(dǎo)時(shí)間的選擇 在目的蛋白的發(fā)酵過程中，誘導(dǎo)時(shí)間是一個(gè)重要參數(shù)。誘導(dǎo)時(shí)間不足，目的蛋白表達(dá)量較低；誘導(dǎo)時(shí)間過長，菌體進(jìn)入衰亡期，副產(chǎn)物增加。故以2×YT培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，進(jìn)行目的蛋白誘導(dǎo)時(shí)間的篩選，結(jié)果見圖6。從圖6可以看出，在發(fā)酵2 h后添加IPTG，在誘導(dǎo)2～8 h之間，菌體密度和目的蛋白表達(dá)量均隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加而增加；在誘導(dǎo)8～10 h之間，菌體密度和目的蛋白表達(dá)量均趨于最大值。培養(yǎng)8 h后，菌體密度略有升高，說明還未進(jìn)入衰亡期，但目的蛋白表達(dá)量卻開始下降，故應(yīng)該在培養(yǎng)8 h前結(jié)束誘導(dǎo)，即加入IPTG后，整個(gè)誘導(dǎo)時(shí)間不超過6 h。

圖6 誘導(dǎo)時(shí)間對目的蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Influence of induction time on the target protein expression

2.4.2 誘導(dǎo)劑濃度的優(yōu)化 以優(yōu)化培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在IPTG最佳誘導(dǎo)時(shí)間作用下，分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)[12]，結(jié)果見圖7。從圖7可以看出，IPTG濃度在0～0.8 mmol/L范圍內(nèi)對菌體生長和目的蛋白表達(dá)均無明顯的影響?？紤]到試驗(yàn)成本，最終選擇IPTG 濃度為0.1 mmol/L。

圖7 IPTG濃度對目的蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Influence of IPTG concentration on the target protein expression

2.5 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)

根據(jù)初篩結(jié)果可知，培養(yǎng)基中加入適量的葡萄糖、酪蛋白胨、玉米漿、無機(jī)鹽、微量元素和維生素B1，可以明顯提高目的蛋白的表達(dá)量；在不同培養(yǎng)條件下，誘導(dǎo)時(shí)間對目的蛋白表達(dá)具有顯著影響，IPTG濃度對目的蛋白表達(dá)影響卻不明顯。在30 ℃誘導(dǎo)溫度下，以葡萄糖濃度、酪蛋白胨濃度、玉米漿濃度、無機(jī)鹽含量、微量元素含量、維生素B1含量、IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間作為優(yōu)化因子并設(shè)置5個(gè)優(yōu)化水平進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)，結(jié)果見表1。

應(yīng)用MDAS軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以目的蛋白表達(dá)量為Y值，得到回歸方程Y=4.532-0.832B+2.218E-0.482C+2.436D-1.622G+0.904H-0.099 1A2-0.882D2+1 039.673F2-0.112H2，相關(guān)系數(shù)R2=0.994 3，標(biāo)準(zhǔn)差S=0.046。顯著性水平α=0.01，F(xiàn)(8，1)=1 0667.42，回歸方程進(jìn)行F檢驗(yàn)后得到置信區(qū)間Y=Ym±2.53*S [9.147 51，9.436 46]。通過軟件分析得到最優(yōu)點(diǎn)：A=0.3、B=1.0、C=0.4、D=1.33、E=0.01、F=0.04、G=0.1、H=5，Ym=9.295。將均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化后的最佳搖瓶發(fā)酵條件與原始2×YT培養(yǎng)基對照實(shí)驗(yàn)進(jìn)行對比，結(jié)果見表2。

表1 均勻設(shè)計(jì)因素及水平U10(108)Table 1 Uniform design factors and levels U10(108)

注：A:葡萄糖，0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%；B：蛋白胨，0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%；C：酵母膏,0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%；D：無機(jī)鹽，0.0(不加無機(jī)鹽)、0.5(KH2PO40.05%、K2HPO4·3H2O 0.06%、NaCl 0.2%)、1.0(KH2PO40.1%、K2HPO4·3H2O 0.12%、NaCl 0.4%)、1.5(KH2PO40.15%、K2HPO40.18%、NaCl 0.6%)、2.0(KH2PO40.2%、K2HPO40.24%、NaCl 0.8%)；E：微量元素，0.00%、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%； F：維生素B1，0.00%、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%；G：IPTG，0、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L；H：誘導(dǎo)時(shí)間，2、4、6、8、10 h

表2 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of verify experiment

通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到最佳搖瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果：在2×YT培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為葡萄糖0.3%、酪蛋白胨1.0%、玉米漿0.4%、KH2PO40.133%、K2HPO40.159 6%、NaCl 0.532%、微量元素0.01%、維生素B10.04%；誘導(dǎo)條件：30 ℃、0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)5 h。經(jīng)驗(yàn)證，目的蛋白表達(dá)量為9.23 mg/L，位于置信區(qū)間之間，與理論值接近。與原始對照組相比，濕菌重是對照組的1.50倍，目的蛋白表達(dá)量是對照組的2.27倍。

3 討 論

以治療為目的的抗體類藥物，因其具有高度的靶向性、安全性和有效性，目前已成為藥物研發(fā)中的熱門方向之一，屬于高技術(shù)含量的一類生物新藥，是全世界高端藥企爭相競爭的主要?jiǎng)恿Γ彩且粋€(gè)國家生物科技發(fā)展的重要指標(biāo)[13-15]。本研究以血管內(nèi)皮生長因子單鏈抗體為研究對象，考察不同培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對血管內(nèi)皮生長因子單鏈抗體表達(dá)量的影響，為將該重組大腸埃希菌在發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)大再培養(yǎng)奠定前期的實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。由于血管內(nèi)皮生長因子單鏈抗體表達(dá)量較低，在蛋白電泳中很難區(qū)分該目的條帶，只能在Western圖譜上看見清晰的條帶，但是通過Western圖譜對比各實(shí)驗(yàn)組表達(dá)結(jié)果誤差卻很大，轉(zhuǎn)膜效率、封閉條件、顯色時(shí)間、灰度選擇(數(shù)據(jù)處理時(shí))等都會(huì)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成干擾，故本研究選擇ELISA方法檢測目的蛋白的表達(dá)結(jié)果，相比于Western圖譜具有更高的靈敏度。