張 娟

(南華大學 生藥學與生物科學學院,湖南 衡陽 421001)

酵母的無性絮凝是一個可逆的、鈣離子依賴性的過程[1]。當絮凝現(xiàn)象發(fā)生時，成百上千的細胞會相互吸附到一起，形成細胞團并沉到培養(yǎng)基的底部[2]。引起酵母發(fā)生絮凝的內(nèi)外因素有很多，如營養(yǎng)不足[3-5]或環(huán)境中存在有害刺激時[6]，單個酵母細胞會聚集到一起形成生物膜用以抵抗外界刺激對整個群體的危害。至于內(nèi)部因素，有報道指出一旦某些基因的突變、缺失或高表達會誘導細胞出現(xiàn)絮凝現(xiàn)象[7-8]。如釀酒用酵母的絮凝功能對發(fā)酵工業(yè)就很重要，因為它可以在發(fā)酵結束時為生產(chǎn)者提供一個高效、環(huán)保、簡單、低成本的將酵母細胞和發(fā)酵產(chǎn)品分開的方法[9]。已有研究表明，在粟酒裂殖酵母中絮凝可能受到轉錄因子和編碼絮凝蛋白基因及細胞壁重構酶基因的多重調(diào)控[10]。粟酒裂殖酵母中至少包含9個絮凝基因(gsf2/pfl1和pfl2～pfl9)。其中，gsf2是編碼絮凝蛋白結構域所必需的，pfl2～pfl9則是非必需的[10]。單獨高表達pfl基因對引發(fā)絮凝非常重要[10]。gsf2高表達會使絮凝程度更嚴重，但是pfl9高表達不會出現(xiàn)絮凝程度加深的表型[10]。在粟酒裂殖酵母中涉及絮凝的轉錄因子有Cbf12、Mbx2、Cbf11和Rfl1。Cbf12和Mbx2起轉錄激活作用，而Rfl1和Cbf11起轉錄抑制作用[10-13]。與芽殖酵母中絮凝不同的是粟酒裂殖酵母中的絮凝可以被半乳糖抑制，但是不能被甘露糖、葡萄糖和蔗糖所抑制。這個不同反映出兩種酵母細胞壁結構存在差異。到目前為止，在粟酒裂殖酵母中的10個PPR蛋白已經(jīng)全部被鑒定。PPR1～PPR10在線粒體基因表達過程中發(fā)揮重要作用[14-15]。Ppr9 (Rpo41) 是線粒體RNA聚合酶；Ppr1的作用主要是特異性穩(wěn)定cox2和cox3的mRNA；Ppr2 影響線粒體蛋白的翻譯；Ppr3在細胞內(nèi)的主要作用是穩(wěn)定線粒體中的小rRNA，與芽殖酵母中的Dmr1[16]和人體中的PTCD3[17]具有功能同源性；Ppr4是cox1mRNA特異性的翻譯激活因子；Ppr5是線粒體基因的負調(diào)控因子，Ppr6與芽殖酵母中的Atp13/Aep2序列同源，特異性影響atp9mRNA的穩(wěn)定性；Ppr7影響atp6mRNA的穩(wěn)定性；Ppr8對線粒體基因的翻譯有著微弱的影響[18]；Ppr10是一個線粒體翻譯因子。另外，ppr3、ppr4、ppr6和ppr10的缺失會擾亂細胞內(nèi)鐵平衡，引起細胞調(diào)亡[19]。在前期實驗中，將野生型菌株和Δppr1、Δppr2、Δppr3、Δppr4、Δppr5、Δppr6、Δppr7、Δppr8和Δppr10置于三角瓶中培養(yǎng)至穩(wěn)定期，取少量菌液制成裝片放置于顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)Δppr3、Δppr4、Δppr6和Δppr10會引起細胞凝集。因此選擇Δppr3、Δppr4、Δppr6以及Δppr10繼續(xù)進一步的研究。

在芽殖酵母中細胞絮凝的機制研究已經(jīng)較為成熟，但粟酒裂殖酵母中ppr基因缺失引起細胞絮凝的機制還不清楚。因此，本研究旨在探究粟酒裂殖酵母中ppr基因缺失引起細胞絮凝的機制，為研究粟酒裂殖酵母細胞絮凝的機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 粟酒裂殖酵母單倍體菌株yHL6381、Δppr3、Δppr4、Δppr6、Δppr10、Δppr3Δgsf2、Δppr4Δgsf2、Δppr6Δgsf2、Δppr10Δgsf2，pFA6a-hphMX6為本實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 YES培養(yǎng)基(每100 mL)：葡萄糖3 g，酵母粉0.5 g，亮氨酸(L-leucine)20 mg，尿嘧啶(uracil)20 mg，組氨酸(histidine)20 mg，固體培養(yǎng)基加1.5～2.0 g的瓊脂粉。

1.1.3 儀器與試劑 qRT-PCR試劑盒SYBR?Select Master Mix購自Takara(大連寶生物工程有限公司)；反轉錄試劑盒iScriptTMcDNA Synthesis Kit購自BIO-RAD公司；Yeast Nitrogen Base Without Amino Acids購自Sigma公司；酵母提取物和蛋白胨購自Oxiod公司；其他化學藥品除特殊說明外，均購自南京丁貝。

1.2 方法

1.2.1 絮凝分析 ①絮凝現(xiàn)象的顯微觀察[11]：將WT、Δppr3、Δppr4、Δppr6和Δppr10接種于YES液體培養(yǎng)基中，30 ℃搖床培養(yǎng)至穩(wěn)定期，取適量的菌液制成裝片，利用Zeiss Axio imager A1 microscope(Zeiss，Jena，Germany)(×63)觀察細胞的分布情況。在剩余的菌液中添加EDTA至終濃度為0.01 mol/L，再取適量處理過的菌液制成裝片用于顯微鏡觀察。最后，在剩余的EDTA處理后的菌液中添加不同的金屬離子至終濃度為0.2 mol/L，取菌液制成裝片用于顯微鏡觀察。②不同pH值條件下細胞絮凝程度的測定[20]：收集穩(wěn)定期的WT、Δppr3、Δppr4、Δppr6和Δppr10細胞用ddH2O洗一遍；接著用6 mL 0.1 mol/L EDTA Na2重懸細胞10 min；再用ddH2O洗一遍。最后用各種pH值的琥珀酸Ca2+緩沖液(0.05 mol/L琥珀酸，0.05 mol/L Tris，0.008 mol/L CaCl2，分別用HCl 和NaOH調(diào)節(jié)至各個pH值)處理細胞10 min。震蕩混勻，各取2 mL菌液轉移至2個2 mL離心管中，分別設為對照組和實驗組，小心吸取對照組上層液面200 μL細胞測OD600，記作At=0。實驗組細胞靜置10 min。小心吸取實驗組上層液面200 μL細胞測OD600，記作At=10。計算細胞絮凝率(沉降率)：V=1-At=10/At=0。

1.2.2 實時定量PCR 使用E.Z.N.A.?Yeast RNA Kit (OMEGA BIO-TEK) 抽提WT、Δppr3、Δppr4、Δppr6和Δppr10菌株的總RNA，用RNase-free DNase 消化提取樣品中的DNA，用RevertAidTMFirst Strand cDNA Sythesis Kit (Fermentas) 進行反轉錄獲得cDNA，將cDNA稀釋一定倍數(shù)作為實時熒光定量PCR的模板，本研究以Actin作為內(nèi)參，采用 ΔΔCT 法測定目標基因的相對表達量。計算公式：目標基因的相對表達量=2-ΔΔCT。

2 結果與分析

2.1 ppr3、ppr4、ppr6和ppr10敲除菌產(chǎn)生的細胞凝集現(xiàn)象

已知ppr3、ppr4、ppr6和ppr10的缺失能引起線粒體功能異常。在培養(yǎng)這四個缺陷菌的過程中發(fā)現(xiàn)單獨敲除ppr3、ppr4、ppr6和ppr10基因會引起缺陷菌出現(xiàn)細胞凝集現(xiàn)象。因此，用蔡司顯微鏡對這些菌株的菌懸液進行觀察，結果如圖1所示，野生型yHL6381的細胞均勻分布在顯微鏡視野范圍內(nèi)，而Δppr3、Δppr4、Δppr6和Δppr10呈現(xiàn)出不同程度的細胞聚集現(xiàn)象。

圖1 ppr3、ppr4、ppr6、ppr10的敲除引起細胞絮凝Fig.1 Deletion ofppr3,ppr4,ppr6andppr10cause aggregation of the mutant cells

2.2 ppr3、ppr4、ppr6和ppr10的敲除引起的細胞絮凝

無性絮凝的機制表明細胞表面的半乳糖殘基可能是一種介導細胞之間發(fā)生凝集的受體，一旦培養(yǎng)基中存在游離的半乳糖就會對絮凝現(xiàn)象產(chǎn)生競爭性抑制。為了鑒定Δppr3、Δppr4、Δppr6和Δppr10敲除菌引起的細胞凝集是否屬于無性絮凝，用含有半乳糖的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)野生型菌株和這四個缺陷菌菌株。實驗現(xiàn)象如圖2A所示，在添加半乳糖的培養(yǎng)基中Δppr3、Δppr4、Δppr6和Δppr10細胞凝集現(xiàn)象消失，說明半乳糖可以抑制由這些敲除菌引起的細胞凝集。

為了驗證本研究中的絮凝是否受Ca2+誘導，首先用EDTA處理突變體細胞，使其解絮凝，然后再添加CaCl2。結果如圖2B所示, 添加EDTA可以使這些敲除菌解絮凝，但添加CaCl2后，絮凝又會再次形成，說明這種絮凝是可逆的并且依賴Ca2+。上述結果表明敲除ppr3、ppr4、ppr6和ppr10基因可以引起由Ca2+依賴型半乳糖結合蛋白參與的細胞絮凝。

2.3 不同pH值對Δppr3、Δppr4、Δppr6和Δppr10細胞絮凝的影響

溶液中的pH水平對細胞的絮凝會產(chǎn)生一定的影響。pH的改變主要通過影響細胞表面絮凝因子的蛋白活性進而對細胞的絮凝產(chǎn)生影響。對WT和Δppr3、Δppr4、Δppr6及Δppr10在不同pH情況下的絮凝程度分別進行了檢測，如圖3所示，這幾株ppr缺陷菌在pH 3～pH 8之間絮凝程度最嚴重，而pH小于2時會極大地抑制細胞的絮凝。這一結果說明裂殖酵母細胞絮凝發(fā)生在接近生理條件的pH情況下。

圖2 半乳糖和CaCl2對細胞的處理Fig.2 Cells were treated with CaCl2and galactose

圖3 不同pH值對WT和Δppr3、 Δppr4、Δppr6、Δppr10絮凝的影響Fig.3 The effects of different pH to the flocclation of WT,Δppr3,Δppr4,Δppr6andΔppr10

2.4 不同金屬離子對Δppr3、Δppr4、Δppr6和Δppr10細胞絮凝的影響

除了溶液中的pH水平，金屬離子對于細胞的絮凝也會產(chǎn)生一定的影響。Ca2+是引發(fā)絮凝的一個關鍵因素，它可以通過維系絮凝因子最適的構像而可逆地激活絮凝因子的活性。同時絮凝現(xiàn)象的出現(xiàn)最終還要依賴暴露于細胞表面的糖蛋白與相鄰細胞的半乳糖殘基結合，進而形成細胞團沉淀到培養(yǎng)基中的底部。而Ca2+則直接參與了這種結合，它像個橋梁一樣將糖蛋白與半乳糖殘基緊緊連在一起[21]。那么其他的金屬離子對于Δppr3、Δppr4、Δppr6和Δppr10的絮凝是否也能起到相同的作用？因此，設計實驗來驗證以上假設。用EDTA處理野生型yHL6381和Δppr3、Δppr4、Δppr6以及Δppr10，取出適量細胞液制成裝片，作為自身空白對照。將剩余的細胞液用終濃度為0.2 mol/L陽離子(Ca2+、Mg2+、Na+、K+、Mn2+、Fe3+)處理后，取相同量處理后的細胞懸液制成裝片，用顯微鏡觀察。結果如圖4所示，添加Ca2+、Mg2+、Na+或K+可以緩解這些突變體引起的絮凝，而Mn2+或Fe3+不可以。說明這種絮凝需要Ca2+、Mg2+、Na+或K+的參與，這些離子可能會激活絮凝因子。對照組，添加Fe3+可以誘導突變體和野生型都產(chǎn)生絮凝。

圖4 不同金屬離子對WT和Δppr3、Δppr4、Δppr6及Δppr10絮凝的影響Fig.4 The efects of different metal ions to the flocculation on WT,Δppr3,Δppr4,Δppr6 andΔppr10

2.5 ppr3、ppr4、ppr6和ppr10的敲除引起的編碼絮凝因子基因表達上調(diào)

已經(jīng)通過分析ppr10敲除菌的RNA-seq數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)敲除菌中的基因表達發(fā)生改變。RNA-seq數(shù)據(jù)表明在Δppr10中參與絮凝的5個基因(gsf2、pfl6、pfl8、pfl9和cbf12)上調(diào)超過2倍[19]。其中pfl9和gsf2上調(diào)非常顯著。為了驗證這一結果，使用qRT-PCR來分析在ppr3、ppr4、ppr6和ppr10細胞中已報導的絮凝基因(gsf2、pfl2、pfl3、pfl4、pfl6、pfl7、pfl8、pfl9和SPBPJ4664.02)[10]。結果如圖5A所示，gsf2、pfl6、pfl8和pfl9在突變體中表達上調(diào)，其中pfl9和gsf2上調(diào)的最為明顯。因此，可以推斷Δppr3、Δppr4、Δppr6及Δppr10是通過高表達細胞表面絮凝因子來實現(xiàn)絮凝。Gsf2是一個半乳糖特異性絮凝因子，在粟酒裂殖酵母中對無性絮凝起重要作用[10]。為了驗證gsf2是否影響ppr敲除菌引起的絮凝，構建了雙敲菌，在這些敲除菌的基礎上敲除gsf2。結果發(fā)現(xiàn)敲除gsf2能夠消除由ppr敲除菌引起的絮凝(圖5B)。

圖5 突變體菌株細胞中的一些絮凝基因的表達Fig.5 mRNA levels of some putative adhesion gene in wild-type,Δppr3,Δppr4,Δppr6and Δppr10 cells

2.6 ppr3、ppr4、ppr6和ppr10的敲除引起的編碼細胞壁重構酶基因表達上調(diào)

在裂殖酵母和芽殖酵母中參與細胞壁重構酶的基因對絮凝起著重要作用[10，22]。用qRT-PCR檢測ppr敲除菌中已知的4個編碼細胞壁重構酶的基因agn2、psu1、gas2和Spac4h3.03c的表達。結果如圖6所示，發(fā)現(xiàn)gas2和Spac4h3.03c表達上調(diào)明顯高于agn2和psu1。

圖6 突變體菌株細胞中編碼 細胞壁重構酶基因的表達Fig.6 mRNA levels of cell wall remodeling enzyme gene in wild-type,Δppr3,Δppr4,Δppr6andΔppr10 cells

3 討 論

粟酒裂殖酵母基因組編碼10個PPR蛋白，這10個蛋白沒有表現(xiàn)出序列上的相似性。除了Ppr5，失去其他幾個蛋白中的任何一個，都會對線粒體DNA基因組的表達起負調(diào)控,引起線粒體ETC途徑受損和呼吸缺陷。在ppr敲除菌中，只有Δppr3、Δppr4、Δppr6和Δppr10會引起無性絮凝表型。已有研究報道這四個ppr敲除菌在非發(fā)酵型培養(yǎng)基上表現(xiàn)出嚴重的生長缺陷，并且會引發(fā)線粒體功能異常從而導致體內(nèi)鐵離子失衡，進而促進體內(nèi)ROS水平升高誘發(fā)細胞調(diào)亡[29]。因為絮凝是一種緊密的結構，細胞間存在著很小甚至沒有間隙，所以線粒體功能嚴重受損會使細胞產(chǎn)生如絮凝這樣的防御機制。因此，認為細胞絮凝是一種共保護機制來幫助細胞抵御環(huán)境壓迫[23]。

在芽殖酵母中絮凝主要受到黏著蛋白Flo1、Flo5、Flo9、Flo10、Flo11、Fig2和Aga1的調(diào)控，這些基因的過表達會引起細胞絮凝，其中FLO1最為顯著[24-25]，但FLO1的表達受轉錄因子Flo8和Mss11的調(diào)節(jié)。在粟酒裂殖酵母中絮凝是由絮凝因子和細胞壁重構酶基因共同調(diào)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)ppr3、ppr4、ppr6和ppr10敲除菌中絮凝因子表達明顯上調(diào)，特別是gsf2和pfl9；細胞壁重構酶基因gas2和Spac4h3.03c的表達也明顯上調(diào)。既然絮凝是由絮凝因子及細胞壁重構酶基因控制的，那么ppr3、ppr4、ppr6和ppr10的缺失可能會影響粟酒裂殖酵母的細胞壁特性。另外，很有可能在Δppr3、Δppr4、Δppr6和Δppr10中還有其他尚未確定的轉錄因子也參與了絮凝基因的上調(diào)。還需實驗進一步探究gas2和Spac4h3.03c的表達上調(diào)是如何進行的。

本研究發(fā)現(xiàn)ppr3、ppr4、ppr6和ppr10的缺失會引起由Ca2+依賴型半乳糖結合蛋白參與的細胞絮凝。因此，對ppr基因敲除引起的細胞絮凝機制產(chǎn)生了興趣。研究發(fā)現(xiàn)pH值和金屬離子是影響這類缺陷菌細胞絮凝的因素。通過qRT-PCR技術得出，ppr3、ppr4、ppr6和ppr10的缺失會使細胞內(nèi)編碼絮凝因子和細胞壁重構酶基因表達上調(diào)。綜上所述，線粒體功能異常會誘導絮凝基因表達上調(diào)和細胞壁屬性發(fā)生改變，從而產(chǎn)生絮凝現(xiàn)象。