秦兵維， 聶麥茜,2*， 郭永華， 朱洪勝， 聶紅云， 劉 暢， 嚴(yán) 寒

(1.西安建筑科技大學(xué) 環(huán)境與市政工程學(xué)院，陜西 西安 710055；2.陜西省膜分離技術(shù)研究院，陜西 西安 710055)

鼠李糖脂是一種由微生物發(fā)酵產(chǎn)生的兩親性的表面活性物質(zhì)[1]，具有活性高、生物相容性好、易被生物降解等特點(diǎn)，加之在強(qiáng)堿、高溫、高pH等極端條件下有良好的應(yīng)用效果,因而備受關(guān)注[2-3]。目前國內(nèi)外研究大多集中于以各種植物油為發(fā)酵碳源,通過誘變菌株、優(yōu)化發(fā)酵溫度、pH、氮源等條件來提高鼠李糖脂的產(chǎn)量[4-5]。根據(jù)Burger等[6]的報(bào)道，在鼠李糖脂的合成途徑中，需要大量的脂肪酸作為前體物質(zhì)。而發(fā)酵碳源-油脂是由C16-C18各種脂肪酸和甘油組成，水解油脂可產(chǎn)生所需脂肪酸。然而，現(xiàn)有的關(guān)于油脂水解條件及其水解程度對(duì)鼠李糖脂的產(chǎn)量及其結(jié)構(gòu)的影響研究報(bào)道[7-9]較少。為降低發(fā)酵成本，本研究以銅綠假單胞菌NY3為供試菌株，選擇廢棄的動(dòng)物油為發(fā)酵碳源，研究油脂水解方法、水解程度等對(duì)鼠李糖脂的產(chǎn)量、結(jié)構(gòu)的影響，同時(shí)將不同預(yù)水解條件下發(fā)酵所產(chǎn)鼠李糖脂應(yīng)用于石化企業(yè)所產(chǎn)生的固體油污泥的處理中，探究鼠李糖脂對(duì)NY3菌去除石化企業(yè)油污中石油烴效能的影響，為擴(kuò)大鼠李糖脂的生產(chǎn)和實(shí)際應(yīng)用規(guī)模提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 菌種：銅綠假單胞菌NY3(PseudomonasaeruginosaNY3)，本實(shí)驗(yàn)室分離并鑒定[10]。動(dòng)物油：西安市區(qū)收集廢棄動(dòng)物油，常溫下為半固態(tài)。

1.1.2 培養(yǎng)基 無機(jī)鹽(發(fā)酵)培養(yǎng)基：NH4NO31.0 g，微量元素 1 mL[11]，1 moL/L MgSO4·7H2O溶液 0.5 mL，1 mol/L CaCl2·2H2O溶液 0.1 mL，磷酸鹽緩沖液(K2HPO442 g, NaH2PO428 g) 25 mL，pH 7.8，蒸餾水定容至1 000 mL。121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min，備用。無機(jī)鹽/淀粉(降解)培養(yǎng)基：NH4NO3100 g，NaH2PO456 g，K2HPO484 g，微量元素26 mL，MgSO4·7H2O溶液15 mL(246.4 g/L)，CaCl2·2H2O溶液2.6 mL(147.2 g/L)，沸水完全溶解的淀粉溶液 100 mL，定容至1 000 mL。LB培養(yǎng)基[12]、LB固體培養(yǎng)基[12]。

1.1.3 主要儀器和試劑 液相色譜-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀(LCMS-IT-TOF)，日本SHIMADZU公司，色譜柱為VP-ODS柱(C8, 250 mm×2.0 mm, 4.6 μm)；7000B三重四級(jí)桿氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)，美國Agilent公司，色譜柱為HP-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；6890N氣相色譜儀，美國安捷倫公司；脂肪酶，美國Sigma L3126 Type II型；實(shí)驗(yàn)試劑除正己烷、乙腈、甲酸、乙酸乙酯為色譜純外，其余均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物油的預(yù)水解 動(dòng)物油堿水解(方法參考文獻(xiàn)[13]并改進(jìn))：50 mL錐形瓶中加入8.0 g動(dòng)物油，加入20 mL蒸餾水，40 ℃(動(dòng)物油的熔點(diǎn)為40 ℃)恒溫水浴1.5 h，將溶液轉(zhuǎn)移至離心管，8 000 r/min 離心8 min，取上層。按上述方法將上層用蒸餾水再洗滌一次，取上層。將上層溶液轉(zhuǎn)移至另一50 mL錐形瓶中，加入20 mL 0.1 mol/L NaOH溶液，150 r/min、70 ℃恒溫水解12 h，加HCl調(diào)pH至3～4釋放游離脂肪酸。動(dòng)物油酶水解(方法參考文獻(xiàn)[14]并改進(jìn))：50 mL錐形瓶中加入8.0 g動(dòng)物油，加入20 mL蒸餾水，40 ℃水浴恒溫1.5 h，將溶液轉(zhuǎn)移至離心管，8 000 r/min 離心8 min，取上層。按上述方法將上層用蒸餾水再洗滌一次，取上層。將上層溶液轉(zhuǎn)移至另一50 mL錐形瓶中，加入20 mL 500 mg/L 脂肪酶/磷緩溶液，150 r/min、50 ℃水解6 h，加HCl調(diào)pH至3～4釋放游離脂肪酸。

1.2.2 動(dòng)物油的酸值與脂解率測(cè)定 酸值的測(cè)定：將釋放游離脂肪酸后的水解樣品于8 000 r/min離心8 min后取上層，參照GB 5009.229-2016[15]測(cè)定其酸值。脂解率的測(cè)定：脂解率按公式計(jì)算：Y(%)=S/S0×100%，式中：Y：油脂水解率，%；S：酸值實(shí)測(cè)值，mg/g；S0：酸值理論值，mg/g，酸值理論值以油脂完全水解為油酸C18H34O2計(jì)。

1.2.3 動(dòng)物油預(yù)水解后脂肪酸成分與相對(duì)含量的氣-質(zhì)聯(lián)用分析 將水解所得脂肪酸溶于色譜級(jí)乙酸乙酯，0.2 mL N,O-雙(三甲基硅烷基)乙酰胺60 ℃衍生45 min后過0.22 μm微孔濾膜上樣。氣相色譜條件根據(jù)文獻(xiàn)[16]進(jìn)行改進(jìn)：HP-5毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進(jìn)樣溫度300 ℃，檢測(cè)器溫度300 ℃，以氦氣為載氣，升溫程序?yàn)?00 ℃保持2 min，以5 ℃/min升溫至300 ℃，保持5 min，進(jìn)樣量1 μL。質(zhì)譜條件：70 eV電子能量，燈絲發(fā)射電流200 μA，離子源溫度230 ℃，接口溫度300 ℃。

1.2.4 NY3菌種子液的制備 參考文獻(xiàn)[17]，將NY3菌接種于LB培養(yǎng)基中，31 ℃、150 r/min好氧培養(yǎng)24 h至OD600達(dá)到(1.6±0.05)，備用。

1.2.5 鼠李糖脂的發(fā)酵與提純 NY3菌分別以未預(yù)水解、堿預(yù)水解和酶預(yù)水解后動(dòng)物油為碳源，于31 ℃、150 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)72 h發(fā)酵鼠李糖脂[18]。根據(jù)文獻(xiàn)[19]方法萃取提純鼠李糖脂。

1.2.6 鼠李糖脂的液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(LCMS-IT-TOF)測(cè)定 將鼠李糖脂樣品溶于色譜級(jí)乙腈，用0.22 μm微孔濾膜過濾后注入樣品瓶，待測(cè)。測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[18]。

1.2.7 NY3菌中試處理高濃度石化企業(yè)油污泥 在容量為40 L的反應(yīng)器中依次加入含油泥6 kg的經(jīng)分散預(yù)處理后的油泥∶木屑=7∶1[20](質(zhì)量比)的混合物，10 L NY3菌種子液，1 L無機(jī)鹽/淀粉(降解)培養(yǎng)基，300 mg/L堿、酶預(yù)水解條件下發(fā)酵所產(chǎn)鼠李糖脂，并以不加鼠李糖脂的反應(yīng)體系作為空白對(duì)照組，在31.5 ℃、攪拌速度為150 r/min、曝氣速率為20 L/min的條件下反應(yīng)9 d。每24 h取樣，樣品于8 000 r/min、4 ℃條件下石油醚(沸程60～90 ℃)離心20 min進(jìn)行3次萃取，合并萃取液，待石油醚揮發(fā)干后備用。

1.2.8 氣相色譜法測(cè)定油污泥中石油烴的去除率 將待測(cè)樣品溶于色譜級(jí)正己烷，用0.22 μm微孔濾膜過濾后注入樣品瓶，待測(cè)。測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)水解對(duì)動(dòng)物油酸值及所得脂肪酸組分的影響

2.1.1 預(yù)水解對(duì)動(dòng)物油酸值和脂解率的影響 大量普遍存在的動(dòng)物油是由甘油三酯組成[22]，其水解后可產(chǎn)生大量相應(yīng)脂肪酸和甘油，使油脂的酸值變大，而這些水解產(chǎn)物恰是NY3菌產(chǎn)鼠李糖脂的前體物質(zhì)。據(jù)文獻(xiàn)[23-27]報(bào)道，在適當(dāng)條件下對(duì)油脂進(jìn)行堿性水解或脂肪酶水解，可提升油脂酸值。動(dòng)物油預(yù)水解前和經(jīng)堿、酶預(yù)水解后其酸值與脂解率結(jié)果如表1所示。

表1 動(dòng)物油在不同水解條件下的酸值與脂解率

從表1結(jié)果看出，動(dòng)物油未水解，其酸值僅為19.81 mg/g，經(jīng)堿、酶水解后，酸值分別達(dá)到72.04和73.75 mg/g，說明堿、酶預(yù)水解均能使動(dòng)物油釋放脂肪酸，提高其酸值。3種預(yù)水解方式所得酸值平方差分別為0.012、0.029、0.028，離散程度較低，表明動(dòng)物油經(jīng)堿、酶預(yù)水解所得酸值較為穩(wěn)定，相對(duì)于不水解，堿、酶水解可將動(dòng)物油脂解率分別提高38.5%和39.7%。表1為本研究實(shí)驗(yàn)條件下的最高水解程度，與文獻(xiàn)[13，24-25]報(bào)道的水解程度有一定差距，說明該動(dòng)物油中可能含有大量在此條件下不被水解的雜質(zhì)。

2.1.2 動(dòng)物油預(yù)水解后脂肪酸成分與相對(duì)含量分析 利用GC-MS檢測(cè)動(dòng)物油經(jīng)堿、酶水預(yù)解后的水解產(chǎn)物，兩種預(yù)水解方式下均鑒定出7種脂肪酸，經(jīng)面積歸一法確定它們的含量，結(jié)果如表2所示。

由表2可知，動(dòng)物油作為發(fā)酵碳源，經(jīng)堿、酶預(yù)水解后，所得脂肪酸在種類和相對(duì)含量上無明顯差異，兩種預(yù)水解條件下均產(chǎn)生7種不同游離脂肪酸，含量高低次序依次為油酸>十六酸>十八酸>亞油酸> 9-十六碳烯酸>十四酸>十七酸，說明預(yù)水解方式對(duì)動(dòng)物油水解產(chǎn)物種類并無明顯影響。

表2 動(dòng)物油預(yù)水解所產(chǎn)脂肪酸組分的 GC-MS鑒定結(jié)果及其相對(duì)含量Table 2 The results of GC-MS identification and relative content of fatty acid composition produced from the prehydrolysis of animal oil

2.2 動(dòng)物油預(yù)水解對(duì)NY3菌發(fā)酵鼠李糖脂產(chǎn)量及結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 動(dòng)物油預(yù)水解對(duì)NY3菌發(fā)酵鼠李糖脂產(chǎn)量的影響 由表3可知，動(dòng)物油未預(yù)水解，NY3菌發(fā)酵鼠李糖脂產(chǎn)量為8.28 g/L，碳源轉(zhuǎn)化率為20.70%；經(jīng)堿、酶預(yù)水解后，鼠李糖脂產(chǎn)量和碳源轉(zhuǎn)化率分別提高至15.35、17.63 g/L和38.38%、44.08%，標(biāo)準(zhǔn)差不超過1.640，產(chǎn)量離散程度較低，在實(shí)驗(yàn)方法接受范圍內(nèi)。結(jié)果表明，相對(duì)于動(dòng)物油未預(yù)水解時(shí)所得產(chǎn)量，堿、酶預(yù)水解后鼠李糖脂的產(chǎn)量分別提高85.39%和112.92%，說明堿、酶預(yù)水解可使碳源釋放游離脂肪酸，進(jìn)而促進(jìn)NY3菌分泌鼠李糖脂，且相對(duì)于堿預(yù)水解，酶預(yù)水解可使NY3菌高產(chǎn)14.85%的鼠李糖脂，說明酶預(yù)水解對(duì)碳源的水解程度和鼠李糖脂產(chǎn)量的促進(jìn)作用更為顯著。

表3 動(dòng)物油預(yù)水解對(duì)NY3菌發(fā)酵 鼠李糖脂產(chǎn)量與碳源轉(zhuǎn)化率的影響Table 3 Effect of prehydrolysis of animal oil on the production of rhamnolipids produced by strainP.aeruginosaNY3 and conversion rate of carbon source

2.2.2 動(dòng)物油預(yù)水解對(duì)NY3菌發(fā)酵產(chǎn)鼠李糖脂結(jié)構(gòu)特征的影響 利用液相色譜-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)不同預(yù)水解方式下發(fā)酵所產(chǎn)鼠李糖脂并分析，結(jié)果分別見表4、5、6。

表4 動(dòng)物油未預(yù)水解NY3菌發(fā)酵所產(chǎn)鼠李糖脂的組成及相對(duì)含量

表5 動(dòng)物油經(jīng)堿預(yù)水解NY3菌發(fā)酵所產(chǎn)鼠李糖脂的組成及相對(duì)含量

表6 動(dòng)物油經(jīng)酶預(yù)水解NY3菌發(fā)酵所產(chǎn)鼠李糖脂的組成及相對(duì)含量

由表4、5、6可知，3種預(yù)水解條件下發(fā)酵所得鼠李糖脂中，均存在質(zhì)荷比為475、503、529、621、649的鼠李糖脂組分，5種組分在各鼠李糖脂中相對(duì)含量之和分別為85.88%、69.34%、77.88%，說明預(yù)水解方式對(duì)NY3菌發(fā)酵所產(chǎn)鼠李糖脂主要組分種類并無明顯影響。從鼠李糖脂的單、雙糖脂含量來看，3種預(yù)水解條件下發(fā)酵所得鼠李糖脂單糖脂含量均高于雙糖脂含量，但相對(duì)于碳源未預(yù)水解發(fā)酵所得鼠李糖脂，碳源預(yù)堿水解、預(yù)酶水解后發(fā)酵所得鼠李糖脂中單糖脂含量顯然更高，其中碳源預(yù)酶水解發(fā)酵所得鼠李糖脂單糖脂含量高達(dá)87.32%。說明堿、酶預(yù)水解發(fā)酵碳源均能提高NY3菌發(fā)酵所產(chǎn)鼠李糖脂中單糖脂的含量，且相對(duì)于堿預(yù)水解，酶預(yù)水解發(fā)酵碳源對(duì)所產(chǎn)鼠李糖脂中單糖脂含量的提高作用更明顯，最高可將鼠李糖脂單糖脂含量提高25.25%。

2.3 鼠李糖脂促進(jìn)NY3菌去除石化企業(yè)油污泥中石油烴的效能分析

按照1.2.7中的方法進(jìn)行NY3菌中試處理石化企業(yè)油污泥的實(shí)驗(yàn)，根據(jù)1.2.8對(duì)所得樣品進(jìn)行氣相色譜測(cè)定，反應(yīng)1～9 d石油烴去除率如圖1所示。由圖1可知，反應(yīng)24 h，4種體系油污泥中石油烴的去除率分別為15.62%、42.10%、39.32%、36.33%，投加了鼠李糖脂的反應(yīng)體系石油烴去除率均超過30%，說明反應(yīng)24 h內(nèi)鼠李糖脂能夠促進(jìn)菌株的生長，縮短N(yùn)Y3菌接入到反應(yīng)器后的適應(yīng)期。反應(yīng)9 d，4種反應(yīng)體系的石油烴去除率分別為55.16%、85.99%、85.70%、76.94%，在整個(gè)反應(yīng)周期內(nèi)，不投加鼠李糖脂的反應(yīng)體系石油烴去除率始終低于其余體系，說明當(dāng)鼠李糖脂存在于反應(yīng)體系中時(shí)，NY3菌對(duì)石油烴具有更強(qiáng)的去除能力，表明鼠李糖脂能夠促進(jìn)NY3菌去除油污泥中的石油烴。從投加了鼠李糖脂的3種反應(yīng)體系石油烴的去除率來看，反應(yīng)1～9 d，3種體系中石油烴的去除率高低次序始終為投加未預(yù)水解產(chǎn)Rha的體系>投加堿預(yù)水解產(chǎn)Rha的體系>投加酶預(yù)水解產(chǎn)Rha的體系，說明3種鼠李糖脂對(duì)NY3菌去除油污泥中石油烴的促進(jìn)作用強(qiáng)弱順序?yàn)槲搭A(yù)水解產(chǎn)Rha>堿預(yù)水解產(chǎn)Rha>酶預(yù)水解產(chǎn)Rha，這一順序與此3種鼠李糖脂中雙糖脂的含量高低次序恰好一致，由于3種鼠李糖脂在主要組分上無明顯差異，可知雙糖脂含量高的鼠李糖脂對(duì)NY3菌去除油污泥中石油烴的促進(jìn)作用更為顯著。

圖1 中試條件下鼠李糖脂對(duì)NY3菌去除 石化企業(yè)油污泥中石油烴的影響Fig.1 Effect of rhamnolipids on promotingP.aeruginosaNY3 to remove petroleum hydrocarbon from petrochemical industry oily sludge under pilot test

3 討 論

在NY3菌發(fā)酵產(chǎn)鼠李糖脂前，對(duì)發(fā)酵碳源動(dòng)物油分別進(jìn)行了堿、酶預(yù)水解，為判斷碳源的水解程度并確定其水解產(chǎn)物，對(duì)預(yù)水解前后的碳源進(jìn)行了酸值測(cè)定，并對(duì)水解所得有機(jī)酸進(jìn)行了GC-MS檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)堿、酶預(yù)水解均能釋放動(dòng)物油中的脂肪酸而使其酸值增大，兩種預(yù)水解方式所得水解產(chǎn)物中均含油酸、十六酸、十八酸、亞油酸、 9-十六碳烯酸、十四酸、十七酸等脂肪酸，且含量依次降低。

碳源經(jīng)堿、酶預(yù)水解后，NY3菌發(fā)酵鼠李糖脂的產(chǎn)量和碳源轉(zhuǎn)化率均明顯提高，結(jié)果表明，脂肪酸能作為NY3菌發(fā)酵產(chǎn)鼠李糖脂的前體物質(zhì)，從油脂中提前釋放它們，有利于提高鼠李糖脂產(chǎn)量。LCMS-IT-TOF檢測(cè)結(jié)果表明，3種預(yù)水解方式下發(fā)酵所產(chǎn)鼠李糖脂的主要組分無明顯差異，且單糖脂含量均高于雙糖脂含量，相對(duì)于未預(yù)水解碳源，發(fā)酵堿、酶預(yù)水解碳源所產(chǎn)鼠李糖脂中單糖脂含量更高。

高濃度石化企業(yè)油污泥的中試處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，整個(gè)處理周期內(nèi)，鼠李糖脂對(duì)油污泥處理效率有明顯促進(jìn)作用，盡管堿、酶預(yù)水解碳源可提高鼠李糖脂的產(chǎn)量，但卻使鼠李糖脂中雙糖脂含量較低，導(dǎo)致其對(duì)NY3菌去除油污泥中石油烴的促進(jìn)效率低于未預(yù)水解碳源所產(chǎn)鼠李糖脂。后期可在預(yù)水解碳源提高鼠李糖脂產(chǎn)量的基礎(chǔ)上，對(duì)NY3菌定向發(fā)酵以特定產(chǎn)鼠李單糖脂或鼠李雙糖脂展開進(jìn)一步研究。