劉萃萃，肖志軍，陸賽花，徐 峰

(1.上海健康醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院南院，上海201499；2.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院南院，上海 201499)

有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(organic anion transporting polypeptides，人類：OATPs，嚙齒類：Oatps)屬溶質(zhì)載體超家族，是動(dòng)物和人體內(nèi)重要的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。OATPs/Oatps調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種內(nèi)、外源性物質(zhì)的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)，其中內(nèi)源性物質(zhì)包括甲狀腺激素、膽酸鹽、類前列腺素等，外源性物質(zhì)包括臨床常用的他汀類降脂藥、格列奈類降糖藥以及抗腫瘤藥紫杉醇等[1]。OATPs/Oatps廣泛分布于腸道、肝臟、腎臟、腦等組織，其中人肝臟主要有OATP1B1，OATP1B3和 OATP2B1，大鼠肝臟主要有Oatp1a1，Oatp1a4，和Oatp1b2[2]。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，與正常大鼠相比，慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激(chronic unpredicted mild stress，CUMS)致抑郁大鼠多種藥物藥動(dòng)學(xué)水平發(fā)生變化，同時(shí)伴隨藥物代謝酶(Cyp3a、Cyp2d6和Cyp2b1/2)和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體(Ugt1a1和Ugt2b)mRNA和蛋白表達(dá)水平的改變[3-5]。

為進(jìn)一步闡明抑郁影響藥物代謝的機(jī)制，本研究擬采用SD大鼠建立CUMS大鼠抑郁模型，研究CUMS致抑郁對(duì)大鼠肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)體Oatp1a1、Oatp1a4和Oatp1b2 mRNA和蛋白表達(dá)影響。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重(200±20)g，購(gòu)于上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證：SCXK (滬)2013-0006。大鼠隨機(jī)分為CUMS組和對(duì)照組，每組12只，在造模前飼養(yǎng)1周適應(yīng)環(huán)境，室溫(25±2)℃，相對(duì)濕度40%～70%，自由進(jìn)食。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.2 儀器與試劑

動(dòng)物行為軌跡分析系統(tǒng)(北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技有限公司)；皮質(zhì)酮檢測(cè)試劑盒、去甲腎上腺素檢測(cè)試劑盒(CUSABIO公司)；RNA抽提試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR定量試劑盒(Takara公司)；Oatp1a4、Oatp1b2、GAPDH一抗(Santa Cruz Biotechnology公司)；Oatp1a1一抗(Abcam公司)；BCA蛋白定量試劑盒、5×SDS蛋白上樣緩沖液、預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)液、二抗(碧云天生物技術(shù)有限公司)。

2 方法

2.1 建立CUMS致抑郁大鼠模型

參考文獻(xiàn)[5]方法并加以改進(jìn)。抑郁模型組大鼠單籠飼養(yǎng)，連續(xù)8周給予以下隨機(jī)應(yīng)激：①熱水應(yīng)激(45 ℃，5 min)；②冷水應(yīng)激(4 ℃，5 min)；③束縛1 h；④籠子傾斜(45°，24 h)；⑤夾尾(距尾根1 cm，1 min)；⑥噪音10 min；⑦晝夜顛倒24 h；⑧潮濕墊料24 h；⑨水平搖晃10 min。每天給予一種應(yīng)激，每種應(yīng)激至少被采用5次，同種應(yīng)激不連續(xù)出現(xiàn)，使動(dòng)物不可預(yù)見下一次應(yīng)激的種類。應(yīng)激過程中，模型組大鼠移到另一飼養(yǎng)間內(nèi)單獨(dú)應(yīng)激(兩房間環(huán)境基本一致)，應(yīng)激完成后送回原飼養(yǎng)間。對(duì)照組大鼠正常單籠飼養(yǎng)，不接受任何應(yīng)激。造模前后稱量每只大鼠體重。

2.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)裝置為高40 cm，長(zhǎng)和寬均為100 cm的動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡視頻分析系統(tǒng)，通過分析軟件將可運(yùn)動(dòng)的區(qū)域分為16宮格(25 cm×25 cm)。實(shí)驗(yàn)開始前，將大鼠置于中心方格內(nèi)，記錄大鼠5min內(nèi)穿過的格數(shù)為水平運(yùn)動(dòng)得分，站立或攀附箱壁次數(shù)為垂直運(yùn)動(dòng)得分，測(cè)定完畢后徹底清潔敞箱再進(jìn)行下一只大鼠的實(shí)驗(yàn)。分別于造模前后進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)。

2.3 糖水偏好實(shí)驗(yàn)

分別于造模前后進(jìn)行糖水偏好實(shí)驗(yàn)：第1天給予大鼠兩瓶1%蔗糖水；第2天給予大鼠一瓶純凈水，一瓶1%蔗糖水；第3天大鼠禁食24 h；第4天給予大鼠一瓶純凈水，一瓶1%蔗糖水，測(cè)量1 h內(nèi)飲用的液體量。

糖水偏好百分比(%)=糖水消耗量/(糖水消耗量+純凈水消耗量)×100%。

2.4 血漿去甲腎上腺素和皮質(zhì)酮含量測(cè)定

造模前后，每只SD大鼠眼底靜脈叢采血1.0 ml，置于肝素鈉浸泡過的1.5 ml EP管中，3 000×g轉(zhuǎn)速離心5 min后取上清血漿于-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用酶?lián)免疫吸附法測(cè)定去甲腎上腺素和皮質(zhì)酮含量。

2.5 RT-qPCR檢測(cè)大鼠肝臟Oatp1a1、Oatp1a4和Oatp1b2 mRNA表達(dá)

大鼠斷頭處死后立即解剖，取出肝臟，用0.9%氯化鈉溶液洗滌。依據(jù)說明書的操作步驟，利用Trizol試劑盒提取大鼠肝臟總RNA。用紫外分光光度法在260 nm處測(cè)定RNA濃度。取1 μg總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按說明書操作步驟，得到逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA。以上述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到的cDNA為模板，進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。條件為：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃32 s，共40個(gè)循環(huán)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。mRNA表達(dá)量以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參，通過2-△△Ct公式計(jì)算得到。RT-qPCR引物采用軟件Primer 5設(shè)計(jì)，由上海桑尼生物科技有限公司合成，其序列見表1。

2.6 Western blotting檢測(cè)大鼠肝臟Oatp1a1、Oatp1a4和Oatp1b2 蛋白表達(dá)

取大鼠肝臟組織，剪碎，加入RIPA 裂解液，獲得總蛋白提取物，BCA法進(jìn)行蛋白定量。取50 μg蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗滌后加入二抗孵育1 h，再次TBST洗滌后加入ECL發(fā)光液反應(yīng)2～3 min，置于暗室曝光。

2.7 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 CUMS對(duì)大鼠體重和糖水消耗的影響

如圖1所示，造模開始時(shí)，模型組和對(duì)照組大鼠體重及糖水偏好百分比比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；經(jīng)8周CUMS后，與對(duì)照組相比，模型組大鼠體重增長(zhǎng)減緩，糖水偏好百分比降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

表1 RT-qPCR引物序列及擴(kuò)增片段大小

圖1 CUMS對(duì)大鼠體重(A)和糖水偏好百分比(B)的影響 ***P<0.001，與對(duì)照組比較

3.2 CUMS對(duì)大鼠垂直和水平運(yùn)動(dòng)得分的影響

如圖2所示，造模開始時(shí)，模型組和對(duì)照組大鼠垂直和水平運(yùn)動(dòng)得分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；經(jīng)8周CUMS后，與對(duì)照組相比，模型組大鼠垂直和水平運(yùn)動(dòng)得分均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

3.3 CUMS對(duì)大鼠血漿去甲腎上腺素及皮質(zhì)酮含量的影響

如圖3所示，造模開始時(shí)，模型組和對(duì)照組大鼠血漿去甲腎上腺素及皮質(zhì)酮含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；經(jīng)8周CUMS后，與對(duì)照組相比，模型組大鼠血漿去甲腎上腺素及皮質(zhì)酮含量均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3.4 CUMS對(duì)大鼠肝臟Oatp1a1、Oatp1a4和Oatp1b2 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

經(jīng)8周CUMS后，與對(duì)照組相比，模型組大鼠肝臟Oatp1a1、Oatp1a4和Oatp1b2 mRNA表達(dá)水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。Western結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，抑郁模型組大鼠肝臟Oatp1a1、Oatp1a4和Oatp1b2 蛋白表達(dá)均減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖5)。

圖4 CUMS對(duì)大鼠肝臟Oatps mRNA表達(dá)的影響 *P<0.05，**P<0.01，與對(duì)照組比較

圖5 CUMS對(duì)大鼠肝臟Oatps 蛋白表達(dá)的影響 *P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，與對(duì)照組比較

4 討論

應(yīng)激是機(jī)體在各種環(huán)境、社會(huì)及心理因素刺激時(shí)發(fā)生的重要生物學(xué)反應(yīng)，是目前廣泛被認(rèn)同的引起抑郁的主要因素之一。通過不同方式的應(yīng)激方式可誘導(dǎo)出模仿人類抑郁癥狀的動(dòng)物模型，包括行為絕望模型、習(xí)得性無(wú)助模型、社會(huì)失敗應(yīng)激模型、慢性束縛應(yīng)激模型及CUMS模型等[6]。其中CUMS模型能較好的模擬人類抑郁癥的核心癥狀——快感缺失，因此常被用于抑郁癥發(fā)病機(jī)制和抗抑郁藥的作用機(jī)制研究。本研究采用CUMS建立大鼠抑郁模型，結(jié)果顯示，模型組大鼠體重及糖水偏好百分比下降，提示大鼠出現(xiàn)明顯的快感缺失。此外，模型組大鼠垂直運(yùn)動(dòng)得分和水平運(yùn)動(dòng)得分降低，表明大鼠自主活動(dòng)和探究活動(dòng)減少。

下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA軸)是神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的重要組成部分，在應(yīng)激過程中協(xié)調(diào)各系統(tǒng)的作用，使體機(jī)更好的適應(yīng)環(huán)境。HPA軸功能亢進(jìn)被認(rèn)為是抑郁癥的發(fā)病機(jī)制之一，同時(shí)也是臨床抑郁癥患者常見的神經(jīng)生物學(xué)異常表現(xiàn)之一。本研究中模型組大鼠經(jīng)8周CUMS后，血清皮質(zhì)酮含量升高，表明大鼠HPA軸亢進(jìn)，與以往研究報(bào)道的結(jié)果相似[7]。此外，HPA軸應(yīng)激反應(yīng)與下丘腦去甲腎上腺素的釋放密切相關(guān)。研究表明，不同的應(yīng)激強(qiáng)度和時(shí)間對(duì)大鼠NA分泌的影響有差異性[8]。本研究選擇不同溫和應(yīng)激刺激大鼠，結(jié)果大鼠血清NA濃度升高，提示大鼠腎上腺能信號(hào)通路的激活，以應(yīng)對(duì)應(yīng)激所致機(jī)體內(nèi)環(huán)境的變化。

本研究在成功建立CUMS致大鼠抑郁模型的基礎(chǔ)上，采用RT-qPCR和Western blotting分別檢測(cè)了大鼠肝臟Oatp1a1、Oatp1a4和Oatp1b2 mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠肝臟Oatp1a1、Oatp1a4和Oatp1b2 mRNA和蛋白表達(dá)均降低。不同活性O(shè)APTs能夠影響藥物療效，研究表明，人OATPs基因多態(tài)性能影響藥物吸收、分布和排泄，導(dǎo)致藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的改變，最終影響藥物的療效和毒副作用[9]。大鼠肝臟Oatps與人肝臟OATPs功能類似[10]，因此，本研究結(jié)果提示抑郁患者肝臟OATPs可能表達(dá)下調(diào)，從而影響其底物藥物的吸收、分布和排泄，最終產(chǎn)生臨床療效的差異。

促炎性細(xì)胞因子(proinflammatory cytokines，PCs)對(duì)Oatps的表達(dá)有重要調(diào)節(jié)作用。小鼠分別注射IL-1β，IL-6，TNF-α及這3種細(xì)胞因子的混合物，結(jié)果IL-6或IL-1β能降低Oatp1a1和Oatp1a4 mRNA表達(dá)水平20%～60%，且降低水平隨細(xì)胞因子劑量的增加而提高；而TNF-α能降低Oatp1a4 mRNA表達(dá)水平[11]。此外，PCs在抑郁癥的發(fā)病過程中有重要作用。抑郁癥患者外周血中TNF-α、IL-1β和IL-6等細(xì)胞因子水平升高，重度抑郁癥患者血清IL-6水平明顯高于輕中度患者[12]。長(zhǎng)期慢性輕度應(yīng)激使大鼠外周及中樞各腦區(qū)內(nèi)IL-1β、TNFα和IL-6 mRNA 水平不同程度地升高[13]。本研究的局限性在于未測(cè)定大鼠PCs水平。但基于研究結(jié)果和文獻(xiàn)調(diào)研，我們認(rèn)為CUMS可致大鼠PCs水平升高，而PCs可下調(diào)大鼠肝臟Oatps基因和蛋白表達(dá)降低，因此CUMS下調(diào)Oatps mRNA和蛋白的表達(dá)可能經(jīng)由PCs介導(dǎo)。在后續(xù)的研究中，我們將對(duì)抑郁- PCs -Oatps三者之間的關(guān)聯(lián)及其涉及的分子機(jī)制進(jìn)行探討。

綜上所述，本研究利用CUMS建立的大鼠抑郁模型肝臟Oatp1a1、Oatp1a4和Oatp1b2 mRNA和蛋白表達(dá)均降低，提示抑郁癥患者使用的藥物為OATPs的底物時(shí)，藥代動(dòng)力學(xué)可能發(fā)生變化，需密切關(guān)注臨床療效。