范加騰，陸 峰，許激揚

(中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京，210000)

近20年來，全球真菌感染率急速上升，尤其是深部真菌感染的死亡率高達(dá)40%[1-2]，其中，念珠菌是最主要的條件性致病真菌之一。

目前，能夠治療真菌感染的藥物主要有：唑類抗真菌藥物，此類藥物為抑菌劑，僅能抑制白色念珠菌的生長，而不能起到殺菌效果[3-5]。烯丙胺類抗真菌藥物，主要治療淺部真菌感染。棘白菌素類藥物對白色念珠菌具有殺滅作用[6]。而多烯類抗真菌藥物，以其殺菌效果強、治療范圍廣、耐藥菌較少為廣大醫(yī)務(wù)人員所青睞，本研究以多烯類抗真菌藥物兩性霉素B作為研究對象[7]，來表征該藥物對白色念珠菌的抑制作用。

傳統(tǒng)的用于表征藥物與菌株相互作用的方法非常費時，需要培養(yǎng)菌株以檢測菌株生長或生長行為[8-9]。因此，亟需更加快速、簡便的方法。

動態(tài)表面增強拉曼光譜法(D-SERS)，即在納米溶膠從濕態(tài)到干態(tài)的轉(zhuǎn)變過程中進(jìn)行檢測[10-15]。隨著D-SERS的調(diào)控條件的優(yōu)化以及其本身強大的優(yōu)勢，其應(yīng)用范圍也越來越廣泛，我們研究小組曾將其成功地應(yīng)用于相關(guān)的藥品快檢[16]和對植物性膳食補充劑中摻雜藥物的高靈敏現(xiàn)場檢測[17]中。因此，筆者決定采用動態(tài)增強拉曼光譜法分析藥物與菌株的相互作用，以期建立更加快速、簡便的方法來表征兩性霉素B對白色念珠菌的抑制作用，為后續(xù)對微生物菌株的鑒別和分析藥物的作用效果和機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

硝酸銀(AgNO3)、二水合檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7·2H2O)、丙酮(C2H6O)、乙醇、雙氧水(30% H2O2)、濃硫酸(H2SO4)、硝酸(HNO3)、氫氧化鈉(NaOH)、碳酸氫鈉(NaHCO3)等均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。臨床敏感白色念珠菌311由上海長海醫(yī)院皮膚科提供。實驗用水為三蒸水和去離子水。酵母浸膏、葡萄糖(C6H12O6)、蛋白胨、瓊脂、RPMI 1640(Gibco BRL)、嗎啡啉丙磺酸(MOPS)(Sigma)購自于探索平臺。對照品兩性霉素B(AMB)、米卡芬凈(MCF)購自于大連美倫生物科技有限公司。

YPD培養(yǎng)液：酵母浸膏10 g，葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，加900 ml三蒸水溶解定容至1 000 ml。高溫高壓滅菌(121 ℃，15 min)，放于干燥處備用。

沙氏培養(yǎng)基：葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，瓊脂20 g，加入三蒸水溶解并定容至1 000 ml。121 ℃，15 min高壓蒸汽滅菌。

RPMI 1640培養(yǎng)液：RPMI 1640(Gibco BRL)10 g、NaHCO32.0 g、嗎啡啉丙磺酸(MOPS)(Sigma)34.5 g(0.165 mol/L)，加三蒸水900 ml溶解，用1 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0(25 ℃)。三蒸水定容至1 000 ml，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，分裝后于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

Piranha溶液：30% H2O2與濃硫酸按體積比3∶7稱量，將30% H2O2溶液緩慢加入濃硫酸中，于75 mm培養(yǎng)皿中靜置，冷卻后備用。

1.2 儀器

K-sens拉曼光譜系統(tǒng)(上海復(fù)享公司)；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；TG16-WS型高速離心機(jī)(上海盧湘離心機(jī)有限公司)；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Zeiss EVO MA-10掃描電鏡顯微鏡(德國Carl-Zeiss)；Eppendorf 5417R高速冷凍離心機(jī)，(德國Eppendorf)；Zerasizer Nano ZSE納米粒度儀(英國馬爾文)；JEM-2100F 200 kV場發(fā)射透射電子顯微鏡(日本JEOL)；Vortex-Genie2多功能旋渦混合器(美國Scientific Industries)；不銹鋼立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋(上海三申)；MJX型智能霉菌培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠)；Multiskan MK3酶標(biāo)分析儀(美國Thermo fisher)；TS-1型脫色搖床(江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠)。

1.3 增強試劑的制備與表征

本實驗采用經(jīng)典的Lee法制備納米銀膠[18]。將36 mg的AgNO3溶于200 ml 去離子水中，加熱攪拌至微沸，加入4 ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%復(fù)溶檸檬酸三鈉水溶液，溶液顏色由無色透明逐漸變成淡黃色，再變?yōu)榈疑⒙詭ЬG色，保持微沸30 min停止反應(yīng)，水浴冷卻。即得到粒徑約為75 nm的納米銀球，避光保存。取用銀膠溶液時，由于納米銀的制備過程中有微量表面離子干擾，故將配好的納米銀溶液進(jìn)行表面離子清洗。具體方法為將銀膠溶液以6 500 r/min離心，6 min后除去上清液，以相同體積的去離子水復(fù)溶，振蕩搖勻后備用。同時，通過紫外以及掃描電鏡圖對銀膠進(jìn)行表征。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與MIC80的測定

取-80 ℃冰箱中凍存的臨床白色念珠菌，接種于1 ml YPD培養(yǎng)液中，于30 °C，200 r/min振蕩培養(yǎng)16 h，使白色念珠菌處于指數(shù)生長后期，活化2次。劃板并培養(yǎng)于沙氏培養(yǎng)基上，2 d后長至正常菌株大小。待光譜測定前，將白色念珠菌接種于1 ml YPD培養(yǎng)液中，于上述條件下傳代培養(yǎng)16 h。

白色念珠菌的MIC80測定方法為：將傳代好的白色念珠菌用新鮮RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋至105CFU，分別加入96孔板，加入相應(yīng)體積AMB藥物標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照倍比稀釋法，使AMB濃度分別為16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0 μg/ml ，置于30°C培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h后用酶標(biāo)儀測定每孔光密度值，并計算相應(yīng)的MIC80值。

1.5 光譜檢測

為除去硅片表面有機(jī)物，需要對硅片進(jìn)行清洗。首先將硅片放入新配制并放置冷卻的Piranha溶液中浸泡。待取用時，將硅片取出并用大量去離子水進(jìn)行沖洗，之后分別用丙酮、乙醇、去離子水超聲清洗各1 h，干燥后備用。

考慮菌液中YPD溶液對結(jié)果的干擾，故用去離子水對傳代16 h的菌液清洗。具體方法為將菌液以5 000 r/min進(jìn)行離心4 min，除去上清液，加入等體積去離子水。重復(fù)3次確保YPD培養(yǎng)液去除徹底。

將用二甲基亞砜(DMSO)溶解后的兩性霉素B加入到清洗干凈的菌液中，配成藥物濃度為0、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16 μg/ml的溶液(且DMSO濃度低于2%)，渦旋混勻后放入搖床中，作用時間5、60、120、240 min，將溶液進(jìn)行離心(5 000 r/min，4 min)，去除上清夜，再加入等體積的去離子水，重復(fù)清洗3次。

將清洗后的菌液和納米銀膠混合并渦旋振蕩混勻。取3 μl的混合溶液滴于硅片表面，無需干燥，直接置于拉曼光譜儀下檢測。光譜檢測參數(shù)：激光功率100 mW，積分時間5 s，顯微系統(tǒng)放大倍數(shù)100。

1.6 數(shù)據(jù)的預(yù)處理

使用Matlab 13.0軟件對光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，取光譜波段在550～1 800 cm-1用于光譜分析 (550 cm-1之前有硅片520 cm-1的干擾，而1 800 cm-1后幾乎沒有光譜特征)，后面依次對光譜進(jìn)行基線校正(airPLS法)，平滑(Sgolay法)以及規(guī)范化(Min-Max Normalization)。

2 結(jié)果

2.1 MIC80的測定

常用的微量稀釋法作為一種金標(biāo)準(zhǔn)方法，準(zhǔn)確性好，測得AMB對白色念珠菌的最小抑菌濃度為1 μg/ml。

2.2 納米銀球的表征

在SERS基底中，最常見的是采用納米銀來增強拉曼信號，而Lee法也成為了最經(jīng)典的制備方法。在生命科學(xué)領(lǐng)域，有不少將納米銀球用于細(xì)胞檢測的例子，尤其在微生物的檢測方面。因此，本研究制備納米銀來進(jìn)行微生物的拉曼信號的增強。圖1為納米銀球的紫外表征和掃描電鏡圖。圖1中可以觀察到納米銀近似球狀，因此在紫外圖中表現(xiàn)出的是一個單峰。納米粒子的分散程度通常可用紫外吸收峰的半峰寬來反映。約為50 nm的半峰寬體現(xiàn)出納米粒子具有良好的分散性，納米銀球排列均勻。

2.3 AMB與白色念珠菌作用的光譜圖

將兩性霉素B溶液加入到清洗干凈的菌液中，配成藥物濃度為0、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16 μg/ml的溶液，渦旋混勻后放入搖床中孵育5、60、120、240 min，之后將混合液清洗3遍后滴于硅片表面進(jìn)行檢測。采集到的光譜圖進(jìn)行基線校正，平滑，歸一化后，選取光譜波段550～1800 cm-1，得到結(jié)果如圖2。從圖中可以看出拉曼位移在656 cm-1和729 cm-1處的峰強度最強且變化最為明顯。當(dāng)藥物濃度比較低甚至為0 μg/ml的時候，656 cm-1處的峰強要高于729 cm-1處的峰強度，隨著藥物濃度逐漸升高，656 cm-1處的峰強逐漸降低，729 cm-1處的峰強逐漸升高。

因此，筆者將考察該兩處拉曼位移峰的峰強比和藥物濃度之間的關(guān)系(峰比值法)，來觀察不同濃度的AMB對白色念珠菌拉曼光譜的影響(圖3)。從圖中可以清楚的看出隨著AMB濃度的升高，峰強比迅速下降，當(dāng)達(dá)到一定濃度后峰強比逐漸趨于平穩(wěn)，即AMB濃度在0～2 μg/ml范圍內(nèi)，峰強比與AMB濃度呈負(fù)相關(guān)，而且當(dāng)藥物濃度為0.5 μg/ml時即可接近于高濃度的藥物作用時所表現(xiàn)出來的峰強比，低于AMB對白色念珠菌的最小抑菌濃度(MIC80)1 μg/ml，這在藥物量的使用上要優(yōu)于傳統(tǒng)的方法。從藥物的作用時間上分析，AMB與白色念珠菌作用5 min即可與作用60、120、240 min所測的譜圖效果一致，因此，AMB對白色念珠菌的抑制作用可以在其相互作用只有5 min的時間內(nèi)，用所檢測的拉曼位移656 cm-1與729 cm-1處的峰強比來進(jìn)行表征，與傳統(tǒng)的方法相比，大大節(jié)省了實驗時間。

圖1 75 nm納米銀球的紫外吸收譜(A)和掃描電鏡圖(B)

2.4 MCF與白色念珠菌作用的光譜圖

同時，筆者考察了同樣是殺菌劑的棘白菌素類抗生素米卡芬凈鈉(MCF)對白色念珠菌的抑制作用，將MCF用去離子水溶解，配成藥物濃度為0、0.0312 5、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2、4 μg/ml的菌液，其他條件和分析方法與上述一致，結(jié)果見圖4和圖5。

結(jié)果表明，MCF與白色念珠菌作用的時間為5 min、60 min和120 min時，峰強比與MCF的濃度并沒有明顯的相關(guān)性，作用時間為120 min時，只有高濃度的MCF下才會表現(xiàn)出MCF的濃度與峰強比趨于負(fù)相關(guān)；當(dāng)作用時間高達(dá)240 min時，MCF的濃度與峰強比趨于負(fù)相關(guān)，且只在較高濃度2、4 μg/ml時峰值才趨于平穩(wěn)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于MCF對白色念珠菌的MIC80(0.25 μg/ml)。

圖2 AMB與白色念珠菌不同相互作用時間的拉曼光譜圖 A.孵育5 min；B.孵育60 min；C.孵育120 min；D.孵育240 min(AMB的濃度由a至i依次為16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0 μg/ml)

圖3 不同作用時間對峰比值與AMB濃度的關(guān)系 A.5 min;B.60 min；C.120 min;D.240 min

圖4 MCF與白色念珠菌不同相互作用時間的拉曼光譜圖 A.5 min;B.60 min；C.120 min;D.240 min(MCF的濃度由a至i依次為4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0 μg/ml)

3 討論

液體在硅片表面從濕到干變化的過程中，由于毛細(xì)現(xiàn)象，粒子的間距逐漸變小，團(tuán)聚增加的同時“熱點”也會相應(yīng)地增多，因此待測分析物的SERS信號大大增強(主要增強為電磁增強)。白色念珠菌656 cm-1和729 cm-1的特征峰歸屬于嘌呤代謝物[19-21]，因而產(chǎn)生較大拉曼散射截面的嘌呤代謝物能夠顯示在SERS光譜中。

當(dāng)不同濃度AMB與白色念珠菌相互作用后，AMB濃度在0～2 μg/ml范圍內(nèi)，拉曼位移656 cm-1與729 cm-1處的峰強比與AMB濃度成負(fù)相關(guān)，當(dāng)AMB濃度在低于其最小抑菌濃度0.5 μg/ml時即可接近于高濃度的藥物作用時所表現(xiàn)出來的峰強比，且AMB與白色念珠菌作用時間僅為5 min時即可達(dá)到上述的規(guī)律及優(yōu)點，因此，AMB對白色念珠菌的抑制作用可以在其相互作用只有5 min的時間內(nèi)，用所檢測的拉曼位移656 cm-1與729 cm-1處的峰強比來進(jìn)行表征。

關(guān)于2種殺菌藥物測定結(jié)果的差異，我們的解釋如下：由于MCF類藥物的作用機(jī)制是在細(xì)胞中非競爭性抑制白色念珠菌細(xì)胞壁的重要組成成分β-1,3-葡聚糖合成，破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的完整性導(dǎo)致細(xì)胞死亡，因此其原因是可能由于此類藥物進(jìn)入細(xì)胞后非競爭性抑制β-1,3-葡聚糖合成酶的作用，而不像AMB一樣造成膜孔致使細(xì)胞內(nèi)容物外流，其造成的損害過程較為緩慢的，但因此類藥物抑制了細(xì)胞壁的合成，隨著時間增長，藥物濃度升高，細(xì)胞壁的破壞較為嚴(yán)重，影響細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外流，具有較大散射截面的嘌呤代謝物才能夠被檢測到，在光譜圖中顯示出來。

4 結(jié)論

本研究表明D-SERS法可用于描述AMB對白色念珠菌的殺菌作用，為表征AMB對白色念珠菌的抑制作用提供了一種更簡單、快速的檢測方法。

同時，隨著科技的發(fā)展，方法的穩(wěn)定性得以提高后，還可進(jìn)一步應(yīng)用于其他藥物與菌株，其快速檢測能為臨床病原菌的早期診斷提供基礎(chǔ)。