高天勤，李欣，董圣軍，程春雷，史榮軍，賈龍，王健，劉寶輝

(1.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濱州 256603；2.濱州市人民醫(yī)院，山東 濱州 255610；3.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 濟(jì)南 250101；4.陽信縣人民醫(yī)院，山東 陽信 251800)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，病死率高居?jì)D科惡性腫瘤的首位[1]。卵巢癌對化療藥物的耐藥及癌細(xì)胞自身較強(qiáng)的遷徙能力是導(dǎo)致化療失敗的主要原因，迄今為止，尚無理想的藥物應(yīng)用于臨床克服腫瘤耐藥性。近年來，傳統(tǒng)中藥因來源廣泛、副作用少、病人安全應(yīng)用歷史長及缺乏耐藥性等優(yōu)點(diǎn)越來越受到關(guān)注。其中大量研究發(fā)現(xiàn)，芍藥苷(paeoniflorin，PF)對多種腫瘤細(xì)胞存在抑制作用[2-3]，但PF對卵巢癌細(xì)胞的影響卻鮮有報(bào)道。為了觀察PF是否具有抗卵巢癌的作用，本實(shí)驗(yàn)組通過觀察PF對人上皮性卵巢癌HO8910增殖、凋亡及遷移能力的作用，并對可能的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器 人上皮性卵巢癌HO8910細(xì)胞由濱州醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。芍藥苷購于中國食品藥品檢定研究院；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、噻唑藍(lán)(MTT)購于美國Sigma-Aldrich公司；鼠源抗人凋亡蛋白caspase-3、β-actin、B 淋巴細(xì)胞/白血病-2(Bcl-2)抗體及核因子-κB(NF-κB) p56抗體均購自美國Cell Signaling公司；原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記(TUNEL)檢測試劑盒購買于美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG 購買于中杉金橋生物技術(shù)有限公司；二喹啉甲酸 (BCA)×100蛋白質(zhì)定量測定試劑盒、組織裂解蛋白提取液、蛋白酶抑制劑均購買于上海碧云天生物技術(shù)公司；酶標(biāo)儀為美國Biotech公司產(chǎn)品；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱為美國Thermo公司產(chǎn)品；熒光顯微鏡是日本Olympus公司產(chǎn)品；電泳、濕轉(zhuǎn)移槽及Western blot發(fā)光照相系統(tǒng)為自美國Rio-Red公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 人上皮性卵巢癌HO8910細(xì)胞用10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液于37 ℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，每 1～2 d更換培養(yǎng)液 1 次。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)及參考文獻(xiàn)設(shè)置低、中、高PF劑量組與對照組。其中，二甲基亞砜(DMSO，0.01%)作用于對照組。PF低、中、高劑量組分別在加入0.5、1與2 mg·mL-1PF的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h，PF用DMSO預(yù)溶，并用DMEM培養(yǎng)液稀釋至相應(yīng)濃度。

1.3 MTT 法測細(xì)胞增殖率 將HO8910細(xì)胞接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后實(shí)驗(yàn)組加入含終濃度分別為0.5、1與2 mg·mL-1PF的DMEM培養(yǎng)液。每組設(shè)6個復(fù)孔，在37 ℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)48 h后，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，沖洗后加入MTT的培養(yǎng)液(10 μL)，4 h后棄上清溶液并加入DMSO。震蕩10 min后用酶標(biāo)儀于490 nm波長處測定吸光度(A)值，并重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)3次。

增殖抑制率=(對照組OD值-各組實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.4 TUNEL法檢測細(xì)胞的凋亡率 將上述對照組及各芍藥苷劑量組干預(yù)后的細(xì)胞用4%的多聚甲醛固定1 h后，根據(jù)該實(shí)驗(yàn)試劑盒所述的雙重染色法，TUNEL檢測液可將凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核染呈綠色。DAPI可將所有細(xì)胞的細(xì)胞核染成藍(lán)色。每組細(xì)胞隨即在熒光顯微鏡下選擇6個視野并觀察計(jì)數(shù)。計(jì)算HO8910細(xì)胞凋亡率。

1.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)細(xì)胞遷移率 用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測HO8910細(xì)胞遷移：實(shí)驗(yàn)步驟依據(jù)參考文獻(xiàn)[4]。將混勻的血管內(nèi)皮細(xì)胞以5×105均勻種于6孔板內(nèi)，并鋪滿整個孔板。各組給予上述相應(yīng)處理后，以P200移液器槍頭垂至于6孔板劃出3條平行的“損傷”。用PBS洗細(xì)胞3次，去處劃下的細(xì)胞，加入5%胎牛血清培養(yǎng)基后，放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)8 h。運(yùn)用倒置相差顯微鏡(Olympus BX61)對遷移的各組細(xì)胞進(jìn)行拍照，并計(jì)算出劃痕上下界限之間距離的平均值。將對照組的設(shè)定為100%。

1.6 Western blot法檢測 細(xì)胞內(nèi)caspase-3、Bcl-2、NF-κB p56蛋白表達(dá)水平HO8910細(xì)胞的前期培養(yǎng)與干預(yù)方案同上。各組細(xì)胞處理48 h后通過裂解提取蛋白，并根據(jù)BCA蛋白定量方法所得結(jié)果加入各組蛋白樣品。依次通過電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，然后分別滴加抗NF-κB p56、 Bcl-2、caspase-3和β-actin抗體(1∶1 000稀釋)，4 ℃過夜，清膜、孵育對應(yīng)二抗后，再次洗膜后用配置新鮮發(fā)光液進(jìn)行曝光顯影，Bio-Rad照相系統(tǒng)進(jìn)行照相并用其附帶的軟件分析蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率及遷移率比較各組細(xì)胞處理之后，MTT法測定各組細(xì)胞增殖率；TUNEL染色法測定各組細(xì)胞的凋亡率；細(xì)胞劃痕法測定各組細(xì)胞遷移率。其數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)如表1所示，與對照組相比，PF中劑量組、PF中劑量組細(xì)胞增殖率、遷移率明顯降低，而凋亡率明顯升高(P<0.05，P<0.01)，并且隨PF濃度的增加而效果明顯。

表1 各組細(xì)胞增殖率、凋亡率及遷移率比較

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與PF中劑量組比較，#P<0.05

2.2 各組細(xì)胞內(nèi)caspase-3、Bcl-2、NF-κB p56蛋白表達(dá)比較PF中劑量組、PF中劑量組細(xì)胞內(nèi)caspase-3表達(dá)水平較對照組明顯升高(P<0.05)，Bcl-2、NF-κB p56表達(dá)水平較對照組明顯降低(P<0.05)，且呈現(xiàn)劑量依賴性(P<0.05，P<0.01)，并且隨PF濃度的增加而效果明顯，結(jié)果見表2。

表2 各組細(xì)胞caspase-3、Bcl-2、NF-κB p56表達(dá)比較

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與PF中劑量組比較，#P<0.05

3 討論

卵巢癌惡性程度高，侵襲轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，早期臨床癥狀隱匿不易診斷，治療效果及預(yù)后較差[1,5]。雖然目前對卵巢癌的診療取得了一定的進(jìn)展，但患者的5年死亡率仍維持在25%～30%左右[6]。目前臨床上用于治療卵巢癌的藥物不良反應(yīng)大，且易產(chǎn)生耐藥性[7]。因此，新藥的研發(fā)對改善卵巢癌的治療形成尤為重要。

芍藥苷是白芍的主要有效成分，它具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、保肝、調(diào)節(jié)免疫等多方面功效[8-9]。但近幾年研究顯示，芍藥苷還對部分腫瘤有抑制作用，如胰腺癌、胃癌、黑色素瘤等[2-3,10]。它可以抑制這些腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其死亡。但芍藥苷在卵巢癌的增殖、遷移情況的作用確未有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中，通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)主要證實(shí)芍藥苷對人上皮性卵巢癌HO8910細(xì)胞的增殖、遷移能力的抑制作用。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用不同濃度的(0.5、1與2 mg·mL-1)芍藥苷處理后發(fā)現(xiàn)，芍藥苷可劑量依賴的抑制HO8910細(xì)胞增殖、遷移，促進(jìn)HO8910細(xì)胞的凋亡。

絕大多數(shù)化療藥物殺傷腫瘤細(xì)胞是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的，但化療藥物誘導(dǎo)凋亡的同時也會誘導(dǎo)相應(yīng)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，這是腫瘤化療失敗的主要原因之一。其中被化療藥物所激活的NF-κB是腫瘤細(xì)胞獲得耐藥的重要機(jī)制之一[11]。研究發(fā)現(xiàn)NF-κB一旦激活后即從細(xì)胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)入胞核中調(diào)控抗凋亡因子Bcl-2家族、MDR等蛋白的表達(dá)[12]，抑制caspase凋亡家族的表達(dá)[13]，參與腫瘤細(xì)胞的增值與遷移。本實(shí)驗(yàn)中再次驗(yàn)證了芍藥苷可使NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯降低。本實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)芍藥苷可明顯抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，上調(diào)凋亡蛋白caspase-3的表達(dá)。結(jié)合 MTT及凋亡檢測結(jié)果，可見伴隨著對 NF-κB活性的抑制增強(qiáng)，卵巢癌HO8910細(xì)胞增殖抑制率及凋亡率也隨之增加，遷移率明顯降低。

綜上，芍藥苷具有抑制人上皮性卵巢HO8910細(xì)胞增殖、遷移，并促進(jìn)其凋亡的作用。其作用機(jī)制可能通過NF-κB信號通路以上調(diào)凋亡蛋白caspase-3，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2進(jìn)而誘導(dǎo)HO8910細(xì)胞凋亡，但具體的作用機(jī)制需要進(jìn)一步證實(shí)。