萬(wàn)琪臻，石 翠，馬桂芝

(新疆醫(yī)科大學(xué)，烏魯木齊 830011)

地格達(dá)-4湯為蒙醫(yī)傳統(tǒng)藥方，是由紫花地丁、黃連、梔子和瞿麥4味蒙藥組成的復(fù)方湯劑，具有清糟和歸精等作用，主治血熱相搏、肝膽熱、咽喉腫痛和口渴煩熱等癥。

紫花地丁是地格達(dá)-4湯的主藥，為堇菜科植物紫花地丁(ViolayedoensisMakino.)的干燥全草，收載于《中國(guó)藥典》2015年版一部[1]。紫花地丁性寒，味微苦，具有清熱解毒和涼血消腫的功效[2]，主要含有香豆素類、苷類和黃酮類化合物[3-6]，其中秦皮乙素具有明顯的抗炎、抗菌、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[7]。目前多采用TLC和HPLC法對(duì)秦皮乙素進(jìn)行定性、定量分析[8-11]。

目前，地格達(dá)-4湯的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有檢查項(xiàng)，無(wú)法保證制劑的質(zhì)量可控性以及臨床用藥安全性。因此，本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面優(yōu)化樣品前處理工藝，用HPLC法測(cè)定秦皮乙素的含量，為地格達(dá)-4湯的質(zhì)量控制及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 π NAP cosmosil C18色譜柱(日本Nacalai Tesque公司)；島津LC-20AD液相色譜儀，SPD-M20A光電二極管陣列紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器(日本島津公司)；AB135-S電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；KQ5200DE超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥 地格達(dá)-4湯(批號(hào)分別為：20170912，20171201,20180305和20180423)，紫花地丁(批號(hào)161012)，瞿麥(批號(hào)150716)，黃連(批號(hào)170518)和梔子(批號(hào)170518)，制劑及藥材均由新疆博爾塔拉自治州蒙醫(yī)醫(yī)院提供。秦皮乙素對(duì)照品(批號(hào)C25J7Y18390，上海源葉生物科技有限公司)；甲醇為色譜純(烏魯木齊國(guó)耀化玻儀器有限公司)；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1對(duì)照品溶液 精密稱取秦皮乙素對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為888.00 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.1.2供試品溶液 精密稱取地格達(dá)-4湯(批號(hào)20170912)粉末1 g，置于25 mL量瓶中，加入甲醇超聲處理，放冷，用甲醇定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3陰性樣品溶液 按照地格達(dá)-4湯的處方組成和比例，制成不含紫花地丁的陰性樣品，按照2.1.2項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.2色譜條件 色譜柱為π NAP cosmosil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫為30 ℃；以甲醇-1 mL·L-1磷酸水溶液(21∶79)為流動(dòng)相；流速為1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為345 nm；進(jìn)樣量為10 μL。

2.3樣品前處理方法的優(yōu)化

2.3.1Box-Behnken響應(yīng)面法 根據(jù)前期單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以甲醇體積分?jǐn)?shù)、液料比和超聲溫度為考察因素，各因素選3個(gè)水平，以秦皮乙素峰面積為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化供試品溶液的制備工藝(其中12個(gè)為析因?qū)嶒?yàn)，5個(gè)為中心實(shí)驗(yàn))[12-18]。因素與水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面因素與水平

Tab.1 The factors and levels of response surface method

水平因素A,甲醇體積分?jǐn)?shù)/%B,液料比C,超聲溫度/℃-1404∶13006012∶15018020∶170

2.3.2模型的建立和方差分析 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

采用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表2中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差和多元二次回歸擬合，得到回歸方程：Y=1.339×106+2.099×105A+1.123×105B+83 164.13C-1.161 2×105AB-36 234.25AC+15 798.50BC-2.087×105A2-46 658.57B2-12 760.83C2。

表2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.2 Results of response surface analysis test (n=17)

實(shí)驗(yàn)編號(hào)編碼值A(chǔ),甲醇體積分?jǐn)?shù)/%B,液料比C,超聲溫度/℃峰面積值10001 328 15920001 340 26330001 331 10840001 343 87950001 350 1586-10-1770 86570111 476 818801-11 295 1719-1101 161 5541010-11 281 06711-1-10603 37012-1011 025 940131011 391 205141101 241 073150-1-11 113 367160-111 231 820171-101 327 432

秦皮乙素峰面積回歸方程的方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，模型極顯著(P<0.000 1)，此模型R2=0.997 9，調(diào)整R2=0.995 1，說(shuō)明該模型能解釋99.79%響應(yīng)值的變化，失擬項(xiàng)P>0.05，差異不顯著，即該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合較好。由等高線圖及響應(yīng)面圖可直觀了解各因素之間兩兩交互作用對(duì)地格達(dá)-4湯中秦皮乙素提取效果的影響，見(jiàn)圖1至圖3。比較各因素的F值可知，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果大小的順序：A>B>C，即甲醇體積分?jǐn)?shù)>液料比>超聲溫度。

甲醇體積分?jǐn)?shù)和液料比對(duì)秦皮乙素提取工藝影響的等高線和響應(yīng)面圖見(jiàn)圖1，由圖1可知，固定甲醇體積分?jǐn)?shù)，隨著液料比的升高，峰面積值增加，但增加不明顯；固定液料比，隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增大，峰面積增加，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，峰面積值最大，隨后逐漸減小，因此當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為60%、液料比為20∶1的區(qū)域有最大峰面積值。甲醇體積分?jǐn)?shù)和超聲溫度對(duì)秦皮乙素提取工藝影響的等高線和響應(yīng)面圖見(jiàn)圖2。由圖2可知，固定甲醇體積分?jǐn)?shù)，隨著超聲溫度的增加，峰面積值增加，70 ℃時(shí)峰面積值最大；固定超聲溫度，隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增大，峰面積值增加，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，峰面積值最大，隨后逐漸減小，因此當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為60%、超聲溫度為70 ℃時(shí)有最大峰面積值。液料比和超聲溫度對(duì)秦皮乙素提取工藝影響的等高線和響應(yīng)面圖見(jiàn)圖3。由圖3可知，固定液料比，隨著超聲溫度的增加，峰面積持續(xù)增大，70 ℃時(shí)峰面積最大，但趨勢(shì)不明顯；固定超聲溫度，隨著液料比的增加，峰面積持續(xù)增大，20∶1時(shí)峰面積最大，由此可得，液料比為20∶1，超聲溫度為70 ℃時(shí)有最大峰面積值。

表3 秦皮乙素峰面積回歸方程的方差分析結(jié)果

Tab.3 Results of regression equation analysis of aesculetin peak area

方差來(lái)源平方和自由度均方和FP顯著性模型8.193×101199.103×1010361.77<0.000 1??A,甲醇體積分?jǐn)?shù)/%3.524×101113.524×10111 400.34<0.000 1??B,液料比1.010×101111.010×1011401.28<0.000 1??C,超聲溫度/℃5.533×101015.533×1010219.88<0.000 1??AB1.039×101111.039×1011412.94<0.000 1??AC5.252×10915.252×10920.870.002 6?BC9.984×10819.984×1083.970.086 7A21.834×101111.834×1011728.68<0.000 1??B29.166×10919.166×10936.430.000 5??C26.856×10816.856×1082.720.142 8殘差1.761×10972.516×108失擬項(xiàng)1.432×10934.774×1085.800.062 3純誤差3.293×10848.233×107總和8.211×101116

注：*P<0.05表示差異顯著；**P<0.01表示差異極顯著。

圖1 甲醇體積分?jǐn)?shù)和液料比對(duì)秦皮乙素提取工藝影響的等高線和響應(yīng)面

Fig.1 Response surface and contour of the effects of methanol volume fraction and the liquid-to-solid ratio on extraction process of aesculetin

圖2 甲醇體積分?jǐn)?shù)和超聲溫度對(duì)秦皮乙素提取工藝影響的等高線和響應(yīng)面

Fig.2 Response surface and contour of the effects of methanol volume fraction and ultrasonic temperature on extraction process of aesculetin

圖3 液料比和超聲溫度對(duì)秦皮乙素提取工藝影響的等高線和響應(yīng)面

Fig.3 Response surface and contour of the effects of liquid-to-solid ratio and ultrasonic temperature on extraction process of aesculetin

用回歸模型進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，綜合評(píng)分峰面積預(yù)測(cè)值為1.490 79×106，最優(yōu)條件為：體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇，液料比為20∶1，70 ℃超聲提取。

2.3.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)Design Expert 8.0.6軟件給出的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。平行3次，實(shí)際秦皮乙素的峰面積值為1 462 666，1 449 989和1 476 818，平均峰面積值為1 463 158，與預(yù)測(cè)值之間的相對(duì)誤差僅為1.89%，表明模型預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值之間有很好的擬合性，證實(shí)了響應(yīng)面法可用來(lái)分析各因素對(duì)地格達(dá)-4湯中秦皮乙素提取工藝的影響。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1線性關(guān)系與范圍 精密稱取秦皮乙素對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為888.00 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，倍量稀釋得質(zhì)量濃度分別為444.00，222.00，111.00，55.60，27.80，13.90，6.94和3.47 μg·mL-1的系列對(duì)照品溶液，注入液相色譜儀進(jìn)行分析，記錄峰面積，以峰面積(y)對(duì)質(zhì)量濃度(x)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：y=44 291x-171 496，r=0.999 8，表明秦皮乙素質(zhì)量濃度在3.47～888.00 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.2專屬性考察 分別精密吸取2.1項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各10 μL，按照2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，在選定的實(shí)驗(yàn)條件下，目標(biāo)成分峰形對(duì)稱，分離度好，陰性無(wú)干擾。

圖4 HPLC圖

A.對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性樣品溶液；1.秦皮乙素。

Tab.4 HPLC chromatograms

A.reference substance；B.sample solution；C.negative sample solution；1.aesculetin.

2.4.3精密度 精密稱取地格達(dá)-4湯(批號(hào)20170912)粉末1 g，置于25 mL量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇20 mL，70 ℃超聲(200 W，50 kHz)20 min，放冷，用體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。按照2.2項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，并計(jì)算RSD值。測(cè)得秦皮乙素峰面積的RSD值為0.60%，表明儀器精密度良好。

2.4.4穩(wěn)定性 精密稱取地格達(dá)-4湯(批號(hào)20170912)粉末1 g，置于25 mL量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇20 mL，70 ℃超聲(200 W，50 kHz)20 min，放冷，用體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。將供試品溶液在室溫條件下放置0，2，4，6，8，10和12 h后依次吸取10 μL。按照2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，并計(jì)算RSD值。測(cè)得秦皮乙素峰面積的RSD值為1.66%，說(shuō)明供試品溶液在室溫下12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5重復(fù)性 精密稱取同一批地格達(dá)-4湯(批號(hào)20170912)粉末1 g，置于25 mL量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇20 mL，70 ℃超聲(200 W，50 kHz)20 min，放冷，用體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液，平行操作6次。按照2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算秦皮乙素含量及其RSD值。RSD值為1.54%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.6加樣回收率 精密稱取6份已知秦皮乙素含量的地格達(dá)-4湯(批號(hào)20170912)粉末1 g，置于25 mL量瓶中，分別加入一定質(zhì)量的秦皮乙素對(duì)照品，加入體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇20 mL，70 ℃超聲(200 W，50 kHz)20 min，放冷，用體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液，按照2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積值并計(jì)算平均加樣回收率及RSD值。結(jié)果平均加樣回收率為96.0%，RSD值為0.93%，表明該方法準(zhǔn)確度較好。見(jiàn)表4。

表4 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.4 Results of recovery test (n=6)

編號(hào)本底值/mg加入量/mg測(cè)得值/mg加樣回收率/%平均回收率/%RSD/%10.8690.8231.65595.496.00.9320.8720.8231.67297.330.8700.8231.65595.340.8690.8231.65895.950.8680.8231.65195.160.8710.8231.67097.1

2.4.7樣品的測(cè)定 精密稱取4批次地格達(dá)-4湯粉末各1 g，分別置于25 mL量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇20 mL，70 ℃超聲(200 W，50 kHz)20 min，放冷，用體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液，各批次平行操作3次，按照2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算秦皮乙素含量，結(jié)果批號(hào)分別為20170912，20171201，20180305和20180423的地格達(dá)-4湯中的秦皮乙素含量分別為816±5.61，815±6.08，825±5.33和828±1.21 μg·g-1。

3 討論

3.1地格達(dá)-4湯中指標(biāo)成分的選擇 地格達(dá)-4湯是由紫花地丁、黃連、梔子和瞿麥4味蒙藥組成的復(fù)方湯劑，紫花地丁為方中主藥。其中，紫花地丁主要含有香豆素類、苷類和黃酮類化合物[3-6]，秦皮乙素含量較高[19]，且具有明顯的抗炎、抗菌、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[7]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇以秦皮乙素為指標(biāo)成分，建立其定量分析方法，以控制地格達(dá)-4湯的質(zhì)量，確保其在臨床應(yīng)用中的有效性及安全性。

3.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，秦皮乙素在345 nm處有最大吸收峰，因此選擇345 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3流動(dòng)相的選擇 實(shí)驗(yàn)過(guò)程考察了甲醇-1 mL·L-1磷酸[20]，乙腈-1 mL·L-1磷酸[9]為流動(dòng)相，結(jié)果顯示，當(dāng)甲醇-1 mL·L-1磷酸比例為21∶79時(shí)，分離效果較好，分析時(shí)間適宜，因此選擇甲醇-1 mL·L-1磷酸(21∶79)為流動(dòng)相。

3.4供試品制備工藝的選擇 本實(shí)驗(yàn)首先進(jìn)行了單因素實(shí)驗(yàn)，分別考察了甲醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、超聲時(shí)間、超聲溫度和超聲功率5個(gè)因素對(duì)結(jié)果的影響，結(jié)果表明，甲醇體積分?jǐn)?shù)、液料比和超聲溫度3個(gè)因素影響較大(最優(yōu)水平為：體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇，液料比為12∶1，70 ℃超聲)，因此，將這3個(gè)因素代入響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定地格達(dá)-4湯的制備工藝。對(duì)4批樣品進(jìn)行含量測(cè)定，秦皮乙素的含量分別為816±5.61，815±6.08，825±5.33和828±1.21 μg·g-1。

本實(shí)驗(yàn)建立了地格達(dá)-4湯中秦皮乙素的HPLC定量分析方法，該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可有效控制地格達(dá)-4湯的質(zhì)量。