李 輝 李雷林 高 媛 楊宇純 劉 歡 薛艷紅 劉士平

(三峽大學 生物與制藥學院，湖北 宜昌 443002)

魔芋的有效成分是具有降血壓、降血脂、降血糖、改善腸道功能和減肥等功效的一種膳食纖維——魔芋葡甘聚糖(Konjac Glucomannan, KGM)，同時還能增加飽腹感，是一種廣受歡迎的健康食品[1]．然而，在魔芋產(chǎn)業(yè)進行大規(guī)模推廣開發(fā)的時候，有一個關(guān)鍵的制約因素即魔芋軟腐病，是魔芋生產(chǎn)中危害最嚴重的病害，俗稱“半邊瘋”[2，14]．每年因為魔芋軟腐病都會造成魔芋種植業(yè)的巨大損失，損失可達30%～50%，嚴重的達到80%以上，甚至絕收[2]．在中國發(fā)現(xiàn)的魔芋軟腐病病原菌主要是屬于軟腐歐文氏菌屬(Erwinia)，胡蘿卜軟腐歐氏桿菌胡蘿卜軟腐亞種(Erwiniacarotovorasubsp.carotovora)[3-4]，是一種革蘭氏陰性細菌，其在魔芋的栽培期及貯藏期均可發(fā)病，嚴重影響魔芋的產(chǎn)量和品質(zhì)[5]．

化學防治在植物病蟲害的防治中存在環(huán)境污染、易產(chǎn)生抗藥性等缺點[6]．相比之下，生物防治具有成本低、環(huán)境友好、不易產(chǎn)生抗藥性[7]等優(yōu)點，所以近些年成為防治熱點．其中植物內(nèi)生真菌在生物防治中具有十分重要的地位[8]，是能用來防治魔芋軟腐病的生物藥劑．該生物藥劑由解淀粉芽孢桿菌的發(fā)酵液制成，具有一定的防治和增產(chǎn)作用[9]．本研究從花水疏花水柏枝(myricarialaxiflora)中分離得到一株內(nèi)生細菌16-4，經(jīng)鑒定該內(nèi)生細菌為蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)[10]．結(jié)果表明，平板對峙和模擬田間管理的植株實驗，均可達到理想的防治效果．

1 材料與儀器

1.1 材料

疏花水柏枝的枝葉(三峽流域湖北宜昌境內(nèi)胭脂壩采集)，魔芋軟腐病病原菌(本研究室-80 ℃保藏)．

1.2 培養(yǎng)基

實驗全部使用牛肉膏蛋白胨(LB)培養(yǎng)基：1 L的水中加入5 g牛肉膏，10 g蛋白胨，5 g氯化鈉，20 g瓊脂，pH 7.0～7.2．

1.3 試劑與主要儀器

50 μg/mL的鏈霉素溶液；75%乙醇；3%次氯酸鈉溶液；液氮；DNA凝膠回收試劑盒(Sangon公司)、通用引物27f、1492r；dNTP、10×PCR buffer、ExTaq酶(日本、TaKaRa公司)．主要試驗儀器見表1．

表1 主要儀器

2 方 法

2.1 魔芋拮抗菌的分離和篩選

2.1.1 魔芋拮抗菌的分離

在三峽流域湖北宜昌境內(nèi)胭脂壩采集疏花水柏枝的枝葉，清水洗凈之后用75%乙醇和3%次氯酸鈉溶液進行表面消毒，采用稀釋平板法獲得內(nèi)生細菌．

制備稀釋液：無菌操作取約10 g樣品枝葉，加入無菌水100 mL，將組織研磨搗碎．取1.0 mL搗碎組織液加入無菌水9.0 mL，再用無菌水稀釋7個濃度梯度．

培養(yǎng)：取各濃度梯度稀釋液100 μL分別涂布于LB培養(yǎng)基平板中，恒溫37 ℃培養(yǎng)．

取單菌落：待平板上長出菌落后，根據(jù)形態(tài)挑取單菌落于LB培養(yǎng)基平板中劃線培養(yǎng)，至長出單一菌落，用甘油保藏于-80 ℃的低溫冰箱，記錄并編號．

2.1.2 魔芋拮抗菌的篩選

1)初篩．將保藏的魔芋軟腐病原菌用LB培養(yǎng)基的平板活化，37 ℃培養(yǎng)24 h，拮抗菌用同樣的方法活化；然后，挑取魔芋軟腐病原菌的單菌落接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、100 r/min培養(yǎng)24 h．之后，在無菌條件下取1 mL菌懸液加入100 mL LB固體培養(yǎng)基(45 ℃左右)混勻，倒入培養(yǎng)皿中，再用接種針挑取一環(huán)拮抗菌菌體點接在培養(yǎng)基表面，恒溫37 ℃培養(yǎng)24 h．以50 μg/mL鏈霉素抑菌結(jié)果為對照，觀察抑菌作用．

2)復(fù)篩．操作步驟與初篩相同，選取初篩中效果較好的九株菌進行實驗．觀察抑菌作用．

2.2 內(nèi)生細菌16-4的分子鑒定

將活化的16-4單菌落接種于裝有LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，37 ℃、100 r/min培養(yǎng)24 h．之后，菌懸液進行離心，收集菌體后進行液氮研磨，利用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生工)提取總DNA．

以總DNA為模板，以27f：5′-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3′，1492r：5′-GGTTACCTTGTTTACGACTT-3′為引物擴增其16S rRNA基因[11]．PCR反應(yīng)在20 μL反應(yīng)體系中進行，反應(yīng)體系見表2．

表2 反應(yīng)體系 (單位：μL)

PCR進行反應(yīng)，將其產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，選取1 500 bp左右的條帶進行凝膠回收，送上海生工進行測序分析，重復(fù)2次．

將測得的序列提交至GenBank，并獲得登錄號．再將此序列在GenBank中進行Blast比對，選取同源性較高(≥97%)的菌株的序列用MEGA4.1軟件構(gòu)建16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹，并參照《伯杰氏細菌系統(tǒng)分類學手冊》[12]對內(nèi)生細菌進行分類，確定該菌序列屬性．

2.3 細菌16-4對魔芋軟腐病的拮抗作用

2.3.1 細菌16-4作用于魔芋塊的試驗

取健康魔芋球莖,75%乙醇和次氯酸鈉進行表面消毒，在無菌環(huán)境下切成魔芋塊，在魔芋塊表面切出一個大約2 cm×1 cm×0.5 cm的傷口，隨后將魔芋塊放入有少量無菌水的培養(yǎng)皿中，進行實驗．其中，A組魔芋塊為空白對照，不加任何物質(zhì)；B組魔芋塊中加1 mL無菌水；C組魔芋塊中加入1 mL病原菌培養(yǎng)液；D、E、F組魔芋塊中分別加入病原菌和16-4比例為1∶1、1∶2、1∶3的混合液；放置一周左右觀察情況．

2.3.2 細菌16-4作用于魔芋植株的試驗

相同條件下健康生長的魔芋植株均在魔芋植株靠近球莖的土壤上層部位開一個小口，便于病原菌進行侵染[13]．A組為空白對照，B組植株加100 mL病原菌培養(yǎng)液，C組植株加入100 mL病原菌培養(yǎng)液和100 mL 16-4培養(yǎng)液，D組植株加入100 mL病原菌培養(yǎng)液和300 mL 16-4培養(yǎng)液．4組植株在自然條件下生長2周，期間適當澆水，觀察實驗結(jié)果．

3 結(jié)果與分析

3.1 魔芋拮抗菌篩選結(jié)果

3.1.1 魔芋拮抗菌的初篩結(jié)果

從疏花水柏枝中分離得到的86株內(nèi)生細菌中共篩選到37株內(nèi)生細菌對魔芋軟腐病病原菌具有拮抗作用．分別為：Y2-3，J3-1，J3-2，J3-8，J4-7，J5-2，J5-4，J6-7，3-3，3-4，4-1，4-2，5-1，5-3，5-4，5-6，6-1，6-2，7-3，7-4，8-2，8-3，8-4，8-6，10-2，10-3，12-1，14-1，16-3，16-4，17-1，17-2，18-1，18-2，18-3，ML1，MS1．

3.1.2 魔芋拮抗菌的復(fù)篩結(jié)果

從初篩得到的37株疏花水柏枝內(nèi)生細菌中共篩選到11株對魔芋軟腐病病原菌具有拮抗作用．分別為：J5-4，J6-7，3-4，4-1，8-2，8-4，8-6，16-3，16-4，17-1，17-2．

11株內(nèi)生細菌中對魔芋軟腐病效果最好的一株菌是內(nèi)生細菌16-4，抑菌圈直徑可達75.4 mm．實驗結(jié)果如圖1所示．

圖1 各菌株復(fù)篩結(jié)果

3.2 內(nèi)生細菌16-4的鑒定

在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上菌落呈米白色，表面較干燥，單菌落較小且呈圓形(圖2A和B)，菌體在液體中易分散，不產(chǎn)生色素．顯微形態(tài)表明，菌體為直桿狀，菌體體積較大，分布較緊密．經(jīng)革蘭氏染色后顯紫色，其屬革蘭氏陽性細菌(圖2C)．

提取16-4的總DNA，以其為模板進行PCR擴增，回收的產(chǎn)物送上海生工公司測序．將獲得16S rDNA的ITS序列通過EditSeq軟件拼接，把序列提交至GenBank，獲得登錄號KP072784．選擇與GenBank收錄的同源性比較高的序列與所獲得序列，用Blast與進行比對和同源性行分析，再用MEGA5.0做進化樹(圖2D)．結(jié)果表明：鑒定菌株(16-4)16S rDNA的ITS序列與一株蘇云金芽孢桿菌(BacillusthuringiensisKF687051)的同源性達97%，對照《伯杰氏細菌系統(tǒng)分類學手冊》，比較分析該菌株和蘇云金芽孢桿菌的形態(tài)特征，所以確定該菌株為蘇云金芽孢桿菌，命名為16-4．

A：菌落形態(tài)； B：背面形態(tài)； C：顯微形態(tài)； D：系統(tǒng)發(fā)育樹圖2 16-4的菌落形態(tài)、顯微形態(tài)以及分子鑒定

3.3 16-4對魔芋軟腐病的拮抗作用

3.3.1 細菌16-4作用于魔芋塊的試驗

實驗用病原菌和16-4不同比例的混合培養(yǎng)液作用于魔芋塊，做一組空白對照，一組無菌水作為負對照，4組實驗組，得到結(jié)果如圖3所示．從圖3能夠看出，單接無菌水的魔芋塊(圖3B)為出現(xiàn)輕微變質(zhì)的跡象，單接魔芋軟腐病的魔芋塊(圖3C)出現(xiàn)嚴重變軟變黑的現(xiàn)象，而且伴有惡臭的味道．比較6個圖片(圖3)的實驗結(jié)果，可以看出加了16-4培養(yǎng)液能夠抑制魔芋軟腐病，但是明顯等量添加(圖3D)的效果不夠，需要大量添加(圖3E和F)才有徹底抑制的可能．

A：空白對照； B：魔芋塊中加1 mL無菌水； C：魔芋塊中加入1 mL病原菌培養(yǎng)液； D：魔芋塊中加0.5 mL病原菌培養(yǎng)液和0.5 mL 16-4培養(yǎng)液的混合液； E：魔芋塊中加0.33 mL病原菌培養(yǎng)液和0.67 mL 16-4培養(yǎng)液混合液； F：魔芋塊加0.25 mL病原菌培養(yǎng)液和0.75 mL 16-4培養(yǎng)液的混合液圖3 細菌16-4作用于魔芋塊的效果

3.3.2 細菌16-4作用于魔芋植株的試驗

實驗用病原菌液和不同比例的病原菌和16-4培養(yǎng)液的混懸液澆灌于健康的魔芋植株，生長2周后得到結(jié)果如圖4所示．

A：健康植株； B：土壤里倒入100 mL病原菌培養(yǎng)液； C：土壤里倒入100 mL病原菌培養(yǎng)液和100 mL 16-4培養(yǎng)液的混合液； D：土壤里倒入100 mL病原菌培養(yǎng)液和300 mL 16-4培養(yǎng)液； E：魔芋植株整體比較圖4 細菌16-4作用于魔芋植株的效果

由于魔芋軟腐病能夠侵染有傷口的魔芋植株，所以實驗中的魔芋植株都在接近根的莖部位開了一個小傷口，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與健康植株(圖4A)相比較只加了病原菌的植株就變得枯黃、打蔫(圖4B)，另外兩組魔芋植株由于加了細菌16-4的發(fā)酵液，植株依然在生長(圖4C和D)，但是第2棵魔芋比第3棵長得慢．繼續(xù)培養(yǎng)約1個星期后，將死亡植株(圖4B)挖出發(fā)現(xiàn)球莖壞死(圖4E1)，特別是在傷口部位已經(jīng)干枯，推測死亡原因是由于魔芋軟腐病入侵導致傷口部位軟爛無法傳送營養(yǎng)物質(zhì)而使植株干枯死亡．另外兩組魔芋植株植株依然在生長(圖4C和D)，而且在傷口部位沒有什么明顯變化(圖4E2和E3)．由此可以看出，魔芋軟腐病對魔芋的生長有著致命的作用，而且實驗結(jié)果表明細菌16-4對于魔芋軟腐病具有很強的拮抗作用，能有效抑制魔芋軟腐病病原菌的生長．

4 討 論

實驗經(jīng)過分離篩選得到的86株疏花水柏枝的內(nèi)生細菌，通過平板對峙法發(fā)現(xiàn)有37株對魔芋軟腐病有抑制作用，復(fù)篩之后發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細菌16-4的抑制作用最好，抑菌圈可達75.4 mm．利用16-4進行魔芋塊和植株的實驗，也表明16-4對魔芋軟腐病的確有很強的抑制作用，特別是在植株作用實驗上，說明可以直接利用16-4的菌懸液來防止魔芋軟腐病，降低其發(fā)病率；從生產(chǎn)工藝來說可以節(jié)約成本；從使用方面來說應(yīng)用起來很方便．但從科研角度來說，有必要明確其拮抗機理，所以還需要進一步進行研究，分析是何種物質(zhì)產(chǎn)生的抑制效果．