李佳明，裴紅運，趙文婧，高玉花，張向陽*

1.濟寧醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，272067；2.濟寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，272067

茶葉是我國的國飲，含有咖啡堿、多酚類化合物、維生素類、氨基酸類等，因具有降血脂、減肥、預(yù)防心血管疾病、抗輻射、抗氧化、延緩衰老、助消化等作用，而被譽為健康的自然護衛(wèi)者[1]。古小玲[2]、邱賀媛等[3]曾開展過茶葉中亞硝酸鹽檢測研究，但目前我國尚未制訂茶葉中亞硝酸鹽含量的限量標準，國內(nèi)外學(xué)者對于茶葉中亞硝酸鹽含量的測定研究鮮有報道，因此筆者對不同種類發(fā)酵茶中亞硝酸鹽含量進行了測定，并建立了一套快速的測定方法，以供行業(yè)相關(guān)人員參考。

一、材料與方法

1.試劑與儀器

（1）實驗材料

市場購買的半發(fā)酵茶（鐵觀音、大紅袍），全發(fā)酵茶（正山小種、金駿眉），后發(fā)酵茶（湖南安化黑茶、云南普洱茶）。

（2）實驗儀器

754型紫外可見分光光度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、電子天平FA2104N（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、高速粉碎機、硅膠干燥器、KQ5200DV 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、雙列八孔電熱恒溫水浴鍋、UPD-IV-10T（純水型）優(yōu)普系列超純水器（四川優(yōu)普超純科技有限公司）、常用實驗玻璃儀器。

（3）實驗試劑

所用試劑均為分析純（亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、硼酸鈉、對氨基苯磺酸、二鹽酸-1-萘乙二胺、亞硝酸鈉、濃鹽酸、冰醋酸、濃硫酸、堿式乙酸鉛），所用水為超純水（自制）。

2.超聲萃取-重氮偶合光度法

（1）樣品預(yù)處理

取上述市購的6 種茶葉烘干至恒重，分別用高速粉碎機粉碎混勻后裝于密封袋中備用，依次編號為樣品1～6。

（2）樣品中亞硝酸鹽的提取

分別準確稱取3.0 g（精度為0.0001 g）經(jīng)高速粉碎機粉碎混勻的茶葉樣品，分置于6 個250 mL 錐形瓶中，再分別加入70℃熱水[2]約150 mL，量取5 mL飽和硼酸鈉溶液（后發(fā)酵茶量取7.5 mL）加入錐形瓶中，攪拌混勻。將上述6個錐形瓶放入數(shù)控超聲波清洗器中超聲萃取10 min[4]（40 kHz，40 W）。

（3）超聲萃取液的凈化

在6 種萃取液中分別加入2.5 mL 亞鐵氰化鉀溶液（后發(fā)酵茶量取3.75 mL），搖勻；再分別加入2.5 mL 乙酸鋅溶液（后發(fā)酵茶量取3.75 mL），搖勻。冷卻至室溫的6 種萃取液分別轉(zhuǎn)移到6 個250 mL 容量瓶中，加水至刻度，搖勻，放置30 min。分別用濾紙干過濾，棄去初濾液15 mL，濾液備用。

（4）濾液的脫色

取50 mL 經(jīng)凈化處理后的濾液于100 mL 容量瓶中，加1 mL 飽和堿式乙酸鉛溶液，加水定容，搖勻，過濾，棄去初濾液數(shù)滴，在上述濾液中取50 mL 于100 mL 容量瓶中，加0.05 mL 硫酸溶液（4.5 mol/L），加水定容，搖勻，過濾，棄去初濾液數(shù)滴，濾液為提取液備用。

（5）亞硝酸鹽含量的測定

標準曲線的繪制：準確吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL亞硝酸鈉標準液（1 μg/mL），分別置于6 支具塞比色管中，并編號為標1～標6。在每支比色管中分別加入0.4 mL 對氨基苯磺酸溶液（4 g/L），混勻，靜置5 min，然后加入0.2 mL二鹽酸-1-萘乙二胺溶液（2 g/L），定容至10 mL，搖勻，靜置15 min，用分光光度計于540 nm 處測定各溶液的吸光度[5]。以亞硝酸鹽濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線。

不同發(fā)酵茶提取液中亞硝酸鹽含量測定：準確吸取上述6 種脫色液8.0 mL 于6 支具塞比色管中，分別標記為樣1～樣6。于6 支具塞比色管中分別加入0.4 mL 對氨基苯磺酸溶液（4 g/L），混勻，靜置5 min；然后分別加入0.2 mL 二鹽酸-1-萘乙二胺溶液（2 g/L），6支具塞比色管均加水定容至10 mL，混勻，靜置15 min。用1 cm 比色皿，以“標1”為調(diào)零管，將樣品管1～6 于540 nm波長處測定吸光度，讀取數(shù)據(jù)記錄。

根據(jù)標準曲線得出樣品管中亞硝酸鹽的濃度，并按下式計算樣品中亞硝酸鹽的含量。

式中： X 為樣品中亞硝酸鹽的含量（mg/kg）；A1為樣液中亞硝酸鹽的質(zhì)量（μg）；m為樣品的質(zhì)量（g）；V1為測定用樣液體積（mL）；V0為樣品處理液總體積（mL）。

3.水浴提取-重氮偶合光度法

在上述實驗開始的同時，按照國標方法——水浴提取-重氮偶合光度法，測定不同發(fā)酵茶中亞硝酸鹽含量[6]。

二、結(jié)果與分析

1.亞硝酸鹽標準曲線的繪制

測得標準亞硝酸鹽溶液各管的吸光度依次為0、0.022、0.042、0.062、0.082、0.099，以亞硝酸鹽濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線（圖1）。

圖1 亞硝酸鹽標準曲線

繪制的標準曲線，在0～0.1 μg/mL 范圍內(nèi)亞硝酸鹽質(zhì)量濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為Y=0.99286X+0.00152（Y 為吸光度，X為亞硝酸鹽濃度），相關(guān)系數(shù)為0.99877。

2.超聲萃取-重氮偶合光度法準確度實驗

采用超聲萃取-重氮偶合光度法對已知質(zhì)量濃度為0.10 μg/mL 的亞硝酸鈉標準液進行20 次測定，其平均值為0.0971 μg/mL，偏倚為-0.0029 μg/mL，說明本方法具有良好的準確度，測定結(jié)果見表1。

同時，隨機選取同一樣品6，分別采用超聲萃取-重氮偶合光度法進行20 次亞硝酸鹽的提取檢測，測定結(jié)果見表2。經(jīng)計算，相對標準偏差為4.1320%，說明該方法具有良好的重現(xiàn)性。

3.樣品亞硝酸鹽含量的測定

采用超聲萃取-重氮偶合光度法和水浴提取-重氮偶合光度法進行測定，根據(jù)標準曲線得出樣品中亞硝酸鹽的濃度，并根據(jù)前文公式計算出不同茶葉樣品中亞硝酸鹽的含量。提取檢測過程重復(fù)20 次，取平均值。兩種方法的測定結(jié)果（表3），無差異性。

三、討論

采用超聲萃取-重氮偶合光度法對已知質(zhì)量濃度為0.10 μg/mL 的亞硝酸鈉標準液進行20 次測定的偏倚為-0.0029 μg/mL，說明該方法具有良好的準確度。同時采用該方法對云南普洱茶樣本進行20 次亞硝酸鹽提取檢測的相對標準偏差為4.1320%，說明該方法具有良好的重現(xiàn)性。通過超聲萃取-重氮偶合光度法20 次提取測定的鐵觀音、大紅袍、金駿眉、正山小種、安化黑茶、云南普洱茶樣品中的亞硝酸鹽含量平均值分別為0.17、0.50、1.17、1.50、3.87、4.53 mg/kg，水浴提取-重氮偶合光度法20次提取測定的亞硝酸鹽含量平均值分別為0.17、0.47、1.17、1.53、3.90、4.53 mg/kg。對比兩種方法所得數(shù)據(jù)，并無差異性。說明超聲萃取-重氮偶合光度法與常規(guī)國標方法——水浴提取-重氮偶合光度法的測定結(jié)果無差別，但超聲萃取-重氮偶合光度法測定發(fā)酵茶中亞硝酸鹽含量簡便省時，速度快，且不需要加熱，適應(yīng)于批量測定[7]。該方法在蔬菜[4-5]、醬腌菜[8]等食品的亞硝酸鹽檢測中有過使用報道，且都達到了良好的檢測效果，但用于發(fā)酵茶中亞硝酸鹽的檢測未見報道，因此，超聲萃取-重氮偶合光度法測定茶葉樣品中的亞硝酸鹽含量可行。

表1 亞硝酸鹽標準液準確度測定結(jié)果

表2 準確度測定結(jié)果

表3 樣品亞硝酸鹽濃度和含量比較

本實驗采用亞鐵氰化鉀與乙酸鋅反應(yīng)生成的氰亞鐵酸鋅吸附茶中蛋白質(zhì)共沉淀，再經(jīng)定容、靜置、干過濾去除蛋白質(zhì)。

采取重氮偶合反應(yīng)法測定提取液中亞硝酸鹽含量，其原理是在弱酸條件下，亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸重氮化后，生成的重氮鹽再與二鹽酸-1-萘乙二胺偶合生成紫紅色偶氮化合物[2,9]。

亞硝酸鹽傳統(tǒng)的提取和檢測方法大多用于蔬菜、肉制品、腌菜等樣本的檢測，其提取液的顏色較清澈，檢測過程中并沒有考慮色素的干擾問題，即使脫色，大多是使用活性炭[4,10]。由于茶葉中含有多酚類化合物和茶色素等特殊的成分[2]，所以不同提取液的顏色也深淺不一，這些色素的存在對吸光度有較大影響而干擾檢測結(jié)果。因此，用比色法測定茶葉中的亞硝酸鹽含量時，去除樣品濾液中色素的干擾十分重要。依據(jù)高海榮等[11]的報道，經(jīng)過反復(fù)試驗，發(fā)現(xiàn)在超聲萃取并凈化后的濾液中加入堿式乙酸鉛可以達到良好的脫色效果，優(yōu)于活性炭，并摸索出堿式乙酸鉛的加入量。凈化后的濾液經(jīng)堿式乙酸鉛脫色后，再采用重氮偶合光度法測定提取液中的亞硝酸鹽含量，提高了亞硝酸鹽測定的準確度。該脫色處理方法原理在于堿式乙酸鉛在水溶液中能與黃酮類化合物等水溶性色素生成難溶的鉛鹽或絡(luò)鹽沉淀，并通過在濾液中加入硫酸溶液除去過量堿式乙酸鉛，同時保證溶液在酸性的條件下完成重氮偶合顯色[2]。

本實驗探索并建立了超聲萃取-重氮偶合光度法快速檢測茶葉中亞硝酸鹽含量的檢測方法，可為廠家改進生產(chǎn)方法和行業(yè)人員快速檢測提供參考。