張琳 李歡歡 于淑坤 黃曼 苗敏

摘要為了進(jìn)一步研究SlWDR204的功能，克隆了番茄的SlWDR204基因，通過亞細(xì)胞定位為研究其功能提供線索，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，利用RNAi技術(shù)獲得SlWDR204基因下調(diào)的轉(zhuǎn)基因植株。干旱脅迫試驗表明，轉(zhuǎn)基因番茄對干旱脅迫更加敏感，說明SlWDR204基因正向調(diào)控植物對干旱的響應(yīng)，這一發(fā)現(xiàn)為分子育種提供了新的靶標(biāo)基因，并為闡明植物抗旱的分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞SlWDR204基因;WD40家族蛋白;轉(zhuǎn)基因番茄;抗旱性

中圖分類號S188文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611（2019）01-0096-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.01.030

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

植物由于固著生活的特點(diǎn)而不可避免地會受到環(huán)境不利因素的脅迫，這些脅迫包括生物的和非生物的，其中非生物的脅迫因素包括干旱、高溫、低溫、重金屬離子等[1]。干旱脅迫是植物脅迫中重要脅迫之一，干旱對作物的生長發(fā)育造成了不可逆轉(zhuǎn)的影響，嚴(yán)重影響了作物的品質(zhì)和產(chǎn)量[2]。

WD40家族蛋白在動植物中均有發(fā)現(xiàn)，但其生物學(xué)功能有較大差別。WD40蛋白一般具有一個保守的結(jié)構(gòu)域WD40-repeat，一般含有6～8個WD40-repeat，每個repeat由40～60個保守的氨基酸構(gòu)成，其N端和C端分別有高度保守的二肽GH（Gly-His）和WD（Trp-Asp）[3]。番茄WD40（WD40-repeatdomain）基因家族編碼100多個番茄SlWDR（WD40-repeatdomainfamilymembersintomato）蛋白[3]。前人研究表明，WD40家族蛋白作為CUL4-DDB1泛素連接酶復(fù)合體與底物直接結(jié)合而發(fā)揮作用[4]，參與包括果實發(fā)育、脅迫應(yīng)答、抵抗病害等許多重要生理過程[5-6]。而WD40家族蛋白成員SlWDR204蛋白參與紫外脅迫應(yīng)答和紫外修復(fù)，是生物體中核苷酸切除修復(fù)通路的重要元件[7]。為了進(jìn)一步研究SlWDR204的功能，筆者克隆了番茄的SlWDR204基因，通過亞細(xì)胞定位為研究其功能提供線索，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，利用RNAi技術(shù)獲得SlWDR204基因下調(diào)的轉(zhuǎn)基因植株，并對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行干旱脅迫，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因番茄對干旱脅迫更加敏感，表明SlWDR204基因正向調(diào)控植物對干旱的響應(yīng)，以期為闡明植物抗旱的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與試劑番茄（Solanumlycopersicum）、大腸桿菌（Escherichiacoli）DH5α菌株、農(nóng)桿菌（Agrobacterium）GV2260菌株、質(zhì)粒表達(dá)載體，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pfuDNA聚合酶、T4連接酶、限制性內(nèi)切酶、質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、MS（MurashigeandSkoog）、6-BA（6-Benzylaminopurine）、IAA（indole-3-aceticacid）、KT（Kinetin）、2，4-D（2，4-Dichlorophenoxyaceticacid）、ACE（Acetosyringone）、KANA（Kanamycin）、SB（Carbenicillin）。

1.2番茄SlWDR204基因的克隆根據(jù)SolGenomicsNetwork中SlWDR204基因（Solyc09g031610.2.1）序列信息，設(shè)計SlWDR204-F和SlWDR204-R的特異性引物。

提取番茄野生型幼苗總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR擴(kuò)增SlWDR204基因，PCR條件如下：預(yù)變性95℃4min;變性溫度95℃2min，退火溫度58℃20s，延伸溫度72℃100s，72℃5min，30個循環(huán)。

1.3SlWDR204的亞細(xì)胞定位亞細(xì)胞定位是指某種蛋白或表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞中的具體存在部位，例如存在核內(nèi)、胞質(zhì)內(nèi)或細(xì)胞膜上，GFP是綠色熒光蛋白，在掃描激光共聚集顯微鏡下可以發(fā)出綠色熒光，可以準(zhǔn)確定位蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的位置[3]。構(gòu)建SlWDR204-GFP融合表達(dá)載體，該表達(dá)載體可由35S強(qiáng)啟動子啟動。構(gòu)建成功的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，篩選陽性菌株。采用煙草基因瞬時表達(dá)體系表達(dá)番茄基因SlWDR204。將經(jīng)過乙酰丁香酮誘導(dǎo)的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入煙草葉片中，SlWDR204-GFP經(jīng)過36h表達(dá)，該蛋白經(jīng)過表達(dá)得到一定的積累。經(jīng)處理后的煙草葉片，利用激光共聚焦顯微鏡觀察番茄SlWDR204表達(dá)蛋白的亞細(xì)胞定位。

1.4番茄SlWDR204-RNAi轉(zhuǎn)基因植株的獲得與鑒定用液氮冷激法將SlWDR204-RNAi重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，篩選獲得陽性克隆菌株。利用組織培養(yǎng)的方法，獲得野生型植株的愈傷組織。采用經(jīng)乙酰丁香酮誘導(dǎo)處理后的農(nóng)桿菌侵染番茄愈傷組織，利用組織培養(yǎng)的方法培養(yǎng)，經(jīng)共培養(yǎng)、篩選分化、生根等步驟，培養(yǎng)至幼苗[8]。經(jīng)過煉苗后，移栽至土中培養(yǎng)，篩選獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株。

1.5干旱脅迫試驗為了探究番茄SlWDR204基因?qū)Ω珊得{迫的抵御能力，使用生長狀況相同的番茄SlWDR204-RNAi轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株進(jìn)行試驗。將番茄轉(zhuǎn)基因種子和野生型種子播種于土中，種子萌發(fā)暗處理3d，待種子露白，置于光下生長，光照18h、黑暗6h，溫度26℃。待番茄生長至幼苗，將番茄幼苗移栽至花盤中培養(yǎng)。待花盆中土壤吸水飽和后，將轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株進(jìn)行干旱脅迫處理，觀察番茄植株葉片失水枯萎情況。

2結(jié)果與分析

2.1番茄SlWDR204基因分析番茄SlWDR204基因所編碼的蛋白質(zhì)長度為587aa，該基因定位于番茄的第9號染色體上，由10個內(nèi)含子和11個外顯子構(gòu)成，位于9號染色體的中部位置，番茄SlWDR204基因具有一個特殊DWD功能模塊，DWD模塊擁有125個氨基酸的保守結(jié)構(gòu)域，其所編碼的蛋白質(zhì)含有多個保守的WD（Trp-Asp）、D（Asp）以及R（Arg）重復(fù)氨基酸序列（圖1A）。番茄SlWDR204基因所編碼的蛋白質(zhì)與擬南芥WD40家族同源基因所編碼的蛋白質(zhì)具有較高的同源性，存在不同數(shù)量的重復(fù)保守氨基酸序列，如WD（Trp-Asp）（圖1B）。

2.2SlWDR204基因的克隆提取番茄野生型幼苗總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行核酸瓊脂糖凝膠電泳，番茄SlWDR204基因的長度為1608bp，PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果見圖2，電泳結(jié)果顯示，所得條帶大小位于1000～2000bp，與原基因大小1608bp位置一致，測序結(jié)果顯示基因序列正確。

2.3SlWDR204的亞細(xì)胞定位將帶有SlWDR204-GFP融合表達(dá)載體的農(nóng)桿菌注射煙草的下表皮細(xì)胞，36h后用激光共聚焦顯微鏡觀察番茄SlWDR204表達(dá)蛋白的亞細(xì)胞定位。之前的研究顯示番茄WD40家族SlWDR13、SlWDR25以及SlWDR28等基因的蛋白表達(dá)定位細(xì)胞核中[5]，推測番茄SlWDR204表達(dá)蛋白也定位細(xì)胞核中。亞細(xì)胞定位試驗結(jié)果顯示，GFP蛋白表達(dá)定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，故而在整個細(xì)胞中都呈現(xiàn)綠色，SlWDR204表達(dá)蛋白主要定位于細(xì)胞核（圖3）。

2.4轉(zhuǎn)基因番茄的鑒定通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化和植物組織培養(yǎng)技術(shù)，獲得SlWDR204-RNAi轉(zhuǎn)基因番茄。收取部分轉(zhuǎn)基因番茄葉片樣本，提取番茄葉片中的基因組DNA。植物表達(dá)載體pBI121含有NPTⅡ基因，使用NPTⅡ引物對番茄轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行陽性鑒定（圖4），獲得10株番茄轉(zhuǎn)基因陽性苗。

2.5番茄SlWDR204轉(zhuǎn)基因植株干旱脅迫后的植株形態(tài)試驗發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫8d時，SlWDR204-RNAi轉(zhuǎn)基因植株的部分葉片開始出現(xiàn)輕度失水，干旱脅迫13d時，SlWDR204-RNAi轉(zhuǎn)基因植株的所有葉片都出現(xiàn)嚴(yán)重失水，葉片全部呈現(xiàn)枯萎狀態(tài);而野生型植株葉片在干旱脅迫8d時，葉片呈平展?fàn)顟B(tài)，干旱脅迫13d時，部分葉片呈失水枯萎狀態(tài)（圖5）。該試驗表明，SlWDR204基因有助于提高番茄植株的抗旱能力。

3結(jié)論與討論

利用農(nóng)桿菌侵染番茄愈傷組織獲得SlWDR204基因下調(diào)的番茄轉(zhuǎn)基因株系。通過觀察發(fā)現(xiàn)SlWDR204番茄轉(zhuǎn)基因株系長勢比野生型茂盛，分支較野生型多，說明SlWDR204基因?qū)Ψ焉L發(fā)育存在一定的影響。同時對轉(zhuǎn)基因番茄進(jìn)行干旱脅迫試驗。通過干旱脅迫試驗觀察野生型與SlWDR204-RNAi轉(zhuǎn)基因番茄葉片失水情況，發(fā)現(xiàn)野生型番茄的抗旱能力明顯優(yōu)于SlWDR204-RNAi轉(zhuǎn)基因番茄，確定番茄SlWDR204基因?qū)Ω珊得{迫具有很好的抵御作用。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，SlWDR204與CUL4、DDB1定位相同[3]，均定位于細(xì)胞核中，說明SlWDR204可能與CUL4、DDB1發(fā)生相互作用，共同行使功能。前期的研究結(jié)果也表明，SlWDR204在CUL4泛素E3連接酶復(fù)合體中起到底物識別亞基的作用[4]，SlWDR204蛋白與CUL4形成復(fù)合體之后，具有相應(yīng)的生物學(xué)活性，參與植物生長發(fā)育的調(diào)控，如修復(fù)UV損傷、果實發(fā)育和抵御病害等。也有研究表明WD40家族其他成員（如SlWD6[9]、SlWDR141[10]）在抗旱或耐鹽等方面有重要功能。

目前只對番茄SlWDR204基因的抗旱性進(jìn)行研究，在試驗過程中亦發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株分支較多現(xiàn)象，但未能進(jìn)行深入探究。下一步將探究轉(zhuǎn)基因植株的多分支機(jī)理以及進(jìn)一步研究SlWDR204基因抗旱的分子生物學(xué)機(jī)制。

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