孟溪

（中冶華天工程技術(shù)有限公司，江蘇南京 210009）

藻類是地球上的初級生產(chǎn)者，廣泛分布于海洋、淡水河湖中。藻類可以通過光合作用將大氣中的二氧化碳固定為有機(jī)碳并生成氧氣，從而平衡大氣組分；也可以通過化能異養(yǎng)吸收環(huán)境中的氮磷等營養(yǎng)物，降低富營養(yǎng)化程度。雖然藻類作用巨大，但環(huán)境體系內(nèi)如果過量，形成藻化和赤潮，便會危害水質(zhì)、破壞環(huán)境。我國太湖及滇池水化嚴(yán)重，國家已投入大量人力及財力進(jìn)行治理。對于藻類資源的開發(fā)利用，國內(nèi)外已有許多應(yīng)用案例。例如，褐藻中的海帶、紅藻中的紫菜均屬于常見的食用藻類，富含多種微量元素，有益人體健康；褐藻中含有的藻膠酸鈣鹽可以用于生產(chǎn)人造羊毛、止血藥等醫(yī)藥產(chǎn)品；念珠藻、魚腥藻具有固氮能力，可以用來增強(qiáng)土壤的肥力；藻類細(xì)胞中的生物酶受到重金屬抑制后，會導(dǎo)致細(xì)胞突變、壞死，也可用來檢測水中重金屬的濃度。綜上所述，藻類可用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、環(huán)保等領(lǐng)域，具有一定的經(jīng)濟(jì)價值。

為了研究和開發(fā)利用藻類資源，準(zhǔn)確快捷的鑒定分類方法在持續(xù)發(fā)展。人類最早只能通過肉眼觀察藻類的大規(guī)模活動，顯微鏡的發(fā)明使得微觀層面研究分析變成了可能。隨著光學(xué)儀器的發(fā)展，高效液相色譜儀、流式細(xì)胞儀已成為藻類多樣性分析的主要技術(shù)手段。通過分析藻類的細(xì)胞色素等一些光學(xué)特征，可以得出定性及定量的結(jié)果，效率遠(yuǎn)高于形態(tài)學(xué)鏡檢。隨著20世紀(jì)80年代，分子水平研究的迅猛發(fā)展，三域?qū)W說的提出，使得DNA分子鑒定方法逐漸成為一種新的藻類多樣性研究方法，其在準(zhǔn)確性、鑒定成本、通量方面都有著較大的優(yōu)勢。以上這些方法雖然誕生時間不同，發(fā)展速度差異較大，但具有不同的優(yōu)缺點，需要根據(jù)目標(biāo)藻類的特征進(jìn)行合理的選擇。表1列舉了常用的藻類鑒定分析的技術(shù)及其特點。

2 形態(tài)學(xué)

不同藻類的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)具有差異，某些類群還具有特有的鈣鹽、硅酸鹽外殼，因而形態(tài)差異巨大。這種差異具有類群特性，借助顯微鏡可以進(jìn)行藻類的鑒定和計數(shù)統(tǒng)計。觀察浮游生物的形態(tài)，開創(chuàng)了最早的藻類鑒定及分類體系。赫克爾應(yīng)用顯微鏡首次詳細(xì)地描述記錄了硅藻或者放射蟲等含有硅質(zhì)生物體藻類的形態(tài)。通過形態(tài)學(xué)進(jìn)行藻類鑒定至今仍是一種重要的技術(shù)手段，對于體積較大的藻類（直徑大于10 μm），并且具有特征形態(tài)，便于顯微鏡觀察，形態(tài)學(xué)鏡檢已成為首選方法。

表1 藻類鑒定分析常用方法

藻類大多含有特征性的細(xì)胞色素，種類特異性高，具有特征吸收波長。早期根據(jù)藻類顏色劃分為紅藻、綠藻、棕藻、硅藻四大類群。藻類的光學(xué)特征也屬于形態(tài)學(xué)的一部分，其色素組成、細(xì)胞外形、內(nèi)含物結(jié)構(gòu)都存在類群特異性。雖然這種基于光學(xué)特征的方法很難精確鑒定到物種，但在綱、目等較高分類水平上則十分精確，結(jié)合分析儀器，可以簡單快捷地分析鑒定環(huán)境藻類樣品。目前，應(yīng)用較廣的是高效液相色譜法和流式細(xì)胞儀法。

2.1 高效液相色譜

高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）能夠同時分析藻類的種類與數(shù)量，根據(jù)檢測出的色素豐度可以推測出各個特異性色素所屬類群的相對比例。由于色譜法相對較高的通量以及成本花費(fèi)較低，大規(guī)模環(huán)境樣品的分析十分流行，能夠鑒定絕大多數(shù)藻種的分類信息。聯(lián)合國教科文組織所推薦的Wright方法是利用HPLC分析藻類多樣性的典型代表，可進(jìn)行40多種類胡蘿卜素和12種葉綠素的鑒定。我國學(xué)者先后利用HPLC色素分析方法在廈門海域、東海等地研究了浮游藻的種類特征[2,7]。

2.2 流式細(xì)胞儀

流式細(xì)胞儀是基于藻類的光學(xué)特征進(jìn)行環(huán)境藻類樣品的分析和鑒定。藻類單細(xì)胞排列形成一束液流，液流中的細(xì)胞經(jīng)過一束激光照射而產(chǎn)生散射光。這種散射光與細(xì)胞的體積、形態(tài)、胞內(nèi)物質(zhì)組成和結(jié)構(gòu)具有相關(guān)性，分析散射光譜特征便可分析鑒定藻類的多樣性。Trask[3]利用流式細(xì)胞儀研究了8種分屬于5綱的不同純培養(yǎng)藻類，也發(fā)現(xiàn)了不同類型藻類由于大小和色素含量的差異，其葉綠素等熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)多樣化，需結(jié)合多種色素同時鑒定，才能得出較為精確的結(jié)果。我國學(xué)者徐兆安[4]通過流式細(xì)胞儀，成功分析了太湖藻類的多樣性組成，可處理濃度高達(dá)100萬個/L藻類細(xì)胞的水體。流式細(xì)胞儀在較小細(xì)胞體積（細(xì)胞＜20 μm）的藻類上應(yīng)用最為成功，他們的細(xì)胞基本為球狀，且易形成單細(xì)胞液流，檢測過程穩(wěn)定，便于進(jìn)行定性及定量分析[1]。

3 分子鑒定方法

在進(jìn)入21世紀(jì)，許多研究領(lǐng)域開始進(jìn)入分子特征描述階段。DNA測序技術(shù)進(jìn)入了快速發(fā)展期，從最早的Sanger測序到現(xiàn)在成熟的高通量測序，其測序成本逐漸降低，分析通量呈指數(shù)級提高。分子鑒定方法，首先需要選取被鑒定物種所含有的標(biāo)記基因，通過DNA測序進(jìn)而進(jìn)行序列的相似度比對，進(jìn)而分析被檢測類群的多樣性。結(jié)合高通量測序的分子鑒定方法已成為藻類多樣性研究的主要技術(shù)手段。

3.1 標(biāo)記基因

標(biāo)記基因主要是用來分析物種之間相似度和親緣關(guān)系?，F(xiàn)今生物分類主要根據(jù)“三域?qū)W說”進(jìn)行劃分，根據(jù)SSU rDNA基因的差異，可將地球上的生物分類為原核生物，真核生物、古生菌三個類群。藻類的分類鑒定通常選取rDNA基因和某些功能基因，如光合基因[8]。國內(nèi)外已有很多學(xué)者，如甄毓[5]、王高鴻[9]等人，通過藻類的rDNA及功能基因成功地進(jìn)行藻類的分子鑒定及多樣性研究，得出了精準(zhǔn)快捷的分析結(jié)果。

3.2 DNA測序方法

基因測序技術(shù)的快速發(fā)展使得分子層面的多樣性分析更為便捷。DNA測序方法從最早的Sanger測序（末端終止法），到現(xiàn)在廣泛使用的高通量測序，其測序速度和通量都呈現(xiàn)出指數(shù)級增長。Sanger測序的優(yōu)勢為片段長度適中、測序質(zhì)量高，但是經(jīng)濟(jì)費(fèi)用高以及低通量仍然是其缺點。在現(xiàn)如今的藻類多樣性分析中，高通量測序已逐漸取代了Sanger測序，其價格成本、測序通量都在發(fā)生了革命性的變化。王靖淇[6]、畢宏偉[10]等人已成功使用高通量測序技術(shù)分別對我國遼河及東湖水域進(jìn)行了藻類多樣性的分析和鑒定，并成功探究藻類分布與環(huán)境因子的相關(guān)性。隨著高通量測序的快速發(fā)展，這種技術(shù)手段會更多地應(yīng)用于環(huán)境藻類樣品的鑒定及多樣性分析中。

4 小結(jié)

形態(tài)鑒定和分子鑒定方法是區(qū)分藻類的兩種主要方法，都是基于藻類的特征進(jìn)行多樣性研究。兩種鑒定方法都各有優(yōu)勢，但由于標(biāo)準(zhǔn)不一樣，不同方法得出的藻類之間親緣關(guān)系仍存在一些分歧。這種現(xiàn)象可能是分子鑒定所選取的標(biāo)記基因不太合適，無法在各個分類層級上完美表達(dá)遺傳關(guān)系，也可能是因為形態(tài)學(xué)鑒定存在一些認(rèn)識不足。在未來，隨著測序技術(shù)的發(fā)展以及分類計算方法的優(yōu)化調(diào)整，分子鑒定在藻類資源研究中的應(yīng)用也會逐漸增多，成為主要的技術(shù)手段。