李敏，敬小莉，談文林

（1.達州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川達州 635000；2.四川文理學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，四川達州 635000）

何首烏作為傳統(tǒng)的大宗中藥材，具有極高的藥用價值。其根部入藥，具有活絡(luò)、養(yǎng)血、安神、消癰、解毒（截瘧）等功效[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，何首烏中主要含有二苯乙烯苷類、蒽醌類、磷脂類和黃酮類等具有生物活性和藥理作用的化合物[4-5]。二苯乙烯苷（2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷）是何首烏的主要藥效成分，具有抗氧化、抗衰老、抗老年癡呆、保肝護肝、增強免疫力、降低膽固醇和防止動脈硬化等藥理作用[6-7]，其含量作為何首烏及其制劑的質(zhì)量評價指標(biāo)[8]。目前，對何首烏中二苯乙烯苷類物質(zhì)的研究主要集中在提取方法及提取物的活性研究方面，對于何首烏中二苯乙烯苷的分離純化及其抗氧化活性方面研究較少。因此發(fā)展一種能將提取液進行分離純化，并將純化產(chǎn)物用于有針對性的抗氧化活性研究具有十分重要的現(xiàn)實意義。

大孔吸附樹脂是近幾年發(fā)展起來的一種具有高效吸附性能的有機聚合物吸附劑，具有化學(xué)性能穩(wěn)定、選擇性高、再生簡單和高效節(jié)能等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離純化工藝[9-10]。本文以四川達州產(chǎn)何首烏為研究對象，通過超聲波輔助提取技術(shù)提取何首烏中二苯乙烯苷類物質(zhì)，采用大孔吸附樹脂對二苯乙烯苷類物質(zhì)進行分離純化，并對大孔吸附樹脂進行了篩選，為二苯乙烯苷類物質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)依據(jù)。將分離純化產(chǎn)物進行抗氧化活性研究，檢測何首烏中二苯乙烯苷類物質(zhì)對·OH和DPPH·的清除能力，以及還原力測定，為深入開發(fā)利用四川達州產(chǎn)何首烏提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

何首烏（40 ℃條件下干燥后粉碎過60目篩）：四川達州產(chǎn)；二苯乙烯苷標(biāo)準品：中國標(biāo)準物質(zhì)中心；S-8、NKA-9、D101、D201、D301、AB-8、DM-130型大孔吸附樹脂：上海源葉生物科技有限公司；二苯代苦味肼基自由基（DPPH·）：美國Sigma公司；六氰合鐵酸鉀（K3[Fe(CN)6]）、抗壞血酸（Vc）、水楊酸、硫酸亞鐵（FeSO4）：國藥集團；其他試劑均為分析純；實驗用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550紫外可見分光光度計（日本島津公司）、SHZD3000型多功能全自動振蕩儀（上海電氣有限公司）、DZX-6022B真空干燥箱（上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司）、RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、FS-900N超聲波中藥提取儀（上?？破顑x器設(shè)備有限公司）、FA1004N電子分析天平（上海菁華科技儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準曲線的繪制

準確稱取二苯乙烯苷標(biāo)準品5.0 mg，用無水乙醇溶解后定容至25 mL，即得200 mg/L二苯乙烯苷標(biāo)準品溶液。分別精密吸取200 mg/L二苯乙烯苷標(biāo)準品溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL和3.5 mL置于8個25 mL容量瓶中，用無水乙醇定容，分別測定不同濃度在322 nm下的吸光度，測定3次取平均值，以吸光度A（Abs）為縱坐標(biāo)，二苯乙烯苷濃度C（mg/L）為橫坐標(biāo)作圖，得二苯乙烯苷標(biāo)準曲線，如圖1所示。線性回歸方程y=0.0567x+0.0083，相關(guān)系數(shù)R為0.9999，通過測定樣品溶液的吸光度，以此標(biāo)準曲線方程計算樣品溶液中二苯乙烯苷類物質(zhì)的含量（mg/L）。

圖1 二苯乙烯苷標(biāo)準曲線

1.3.2 樣品中二苯乙烯苷類物質(zhì)的提取、測定及上柱液的制備

二苯乙烯苷類物質(zhì)的提取及測定根據(jù)文獻[11]方法改進，稱50.0 g的何首烏粉末，以體積分數(shù)60%的乙醇作溶劑，料液比為1∶25（g∶mL），采用800 W超聲提取，在65 ℃下提取1.5 h，重復(fù)2～3次，將提取液過濾，即得待測液。由于1.3.1中二苯乙烯苷標(biāo)準品在322 nm波長下有特征吸收峰，因此取適量待測溶液于322 nm下測定吸光度，根據(jù)二苯乙烯苷標(biāo)準曲線方程得到二苯乙烯苷類物質(zhì)的濃度（C），按公式（1）計算苯乙烯苷類物質(zhì)提取率為7.83%。將提取液減壓濃縮，蒸干得二苯乙烯苷粗提物，根據(jù)1.3.1中方法對二苯乙烯苷的純度進行測定，粗提物二苯乙烯苷類物質(zhì)純度為34.62%，將粗提物用適量無水乙醇溶解，即得上柱液。

其中：C表示二苯乙烯苷類物質(zhì)的濃度，g/mL；V表示樣品的體積，mL；M表示何首烏質(zhì)量，g。

喬治·華盛頓大學(xué)兒童心理學(xué)教授葛林斯班認為：“感情能力不只是未來發(fā)展親密關(guān)系與依賴的基石，也是智能與許多認知能力的基礎(chǔ)。在孩子不同的發(fā)展時期，感情能力都扮演主導(dǎo)的角色，學(xué)習(xí)與認知技巧則跟隨其后。即使是數(shù)學(xué)能力，表面看來是與個人無關(guān)，是絕對屬于認知技巧的領(lǐng)域，其實也是透過感情來學(xué)習(xí)。例如：‘很多’對一個2歲的孩子而言，指的是超乎他所預(yù)期的；‘很少’是指比他想要的還少?！?/p>

1.3.3 大孔吸附樹脂預(yù)處理與再生

將市售大孔吸附樹脂用無水乙醇浸泡24 h，使其充分溶脹，用適量乙醇洗至流出液與蒸餾水1∶5混合無渾濁現(xiàn)象，再用5%的鹽酸浸泡2～4 h，用水洗至中性，最后用5%的氫氧化鈉溶液浸泡2～4 h，用水洗至中性，大孔吸附樹脂完成預(yù)處理。實驗使用過的大孔吸附樹脂，先用5%鹽酸浸泡2～4 h，用水洗至中性，最后用5%氫氧化鈉浸泡2～4 h，用水洗至中性，大孔吸附樹脂即可再次使用。

1.3.4 大孔吸附樹脂吸附-解吸實驗

準確稱取5.0 g預(yù)處理過的干大孔吸附樹脂，裝入錐形瓶中，加入已知濃度的何首烏二苯乙烯苷提取液50 mL，以120次/min的速度在室溫下振蕩48 h，大孔吸附樹脂充分吸附二苯乙烯苷后，取上層清液測定二苯乙烯苷類物質(zhì)的濃度，按公式（2）、（3）計算大孔吸附樹脂對二苯乙烯苷類物質(zhì)的吸附量（Q1）和吸附率（E）[12]。

其中：Q1表示吸附量，mg/g；C0表示溶液初始濃度，mg/mL；C1表示完成吸附后溶液濃度，mg/mL；E表示吸附率；M表示大孔吸附樹脂的質(zhì)量，g。

將吸附飽和后的干大孔吸附樹脂加入50 mL無水乙醇，以120次/min的速度在室溫下振蕩48 h，大孔吸附樹脂充分解吸二苯乙烯苷后，取上層清液測定二苯乙烯苷類物質(zhì)的濃度，按公式（4）、(4)計算大孔吸附樹脂對二苯乙烯苷類物質(zhì)的解吸量（Q2）和解吸率（D）[13]。

其中Q2表示解吸量，mg/g；C2表示解吸液濃度，mg/mL；D表示解吸率。

1.3.5 二苯乙烯苷類物質(zhì)的分離純化

1.3.6 抗氧化活性測定

1.3.6.1 清除羥基自由基（·OH）活性測定

采用Fenton反應(yīng)[14-15]，分別取純化二苯乙烯苷和Vc進行實驗，在10 mL比色管中分別加入不同濃度（見圖3）的純化二苯乙烯苷和Vc乙醇溶液1 mL，6 mmol/L的FeSO4溶液1 mL和0.1%的H2O2溶液1 mL，搖勻后靜置5 min，然后加入6 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液1 mL，用蒸餾水定容，搖勻后在37 ℃水浴30 min，離心后在510 nm處測定其吸光度為A2，再將樣品（純化二苯乙烯苷和Vc）用1 mL的蒸餾水代替，測定其吸光度為A0，將體系中H2O2溶液用1 mL蒸餾水代替，測定其吸光度為A1，按公式（6）計算純化二苯乙烯苷和Vc對·OH的清除率。

其中：E表示清除率；A0表示未加樣品的吸光度；A1表示未加雙氧水的吸光度；A2表示加入樣品的吸光度。

1.3.6.2 清除DPPH·活性測定

分別取純化二苯乙烯苷和Vc進行實驗，在10 mL比色管中分別加入不同濃度（見圖4）的純化二苯乙烯苷和Vc乙醇溶液2 mL和0.2 mmol/L的DPPH·乙醇溶液2 mL，用無水乙醇定容后搖勻，室溫避光靜置30 min，在517 nm處測定其吸光度為A2，再將樣品（純化二苯乙烯苷和Vc）用2 mL無水乙醇代替，測定其吸光度為A0，將體系中DPPH·乙醇溶液用2 mL無水乙醇代替，測定其吸光度為A1，按1.3.6.1方法計算純化二苯乙烯苷和Vc對DPPH·的清除率。

1.3.6.3 還原力測定

分別取純化二苯乙烯苷和Vc進行實驗，在25 mL容量瓶中分別加入不同濃度（見圖5）的純化二苯乙烯苷和Vc乙醇溶液2.5 mL，1.0%六氰合鐵酸鉀溶液2.5 mL和0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH=6.6）2.5 mL，搖勻后50 ℃水浴20 min，冷卻后加入10%醋酸2.5 mL和0.1%氯化鐵溶液2.5 mL，用蒸餾水定容，搖勻后靜置10 min，離心后在700 nm處測定其吸光度，在相同濃度條件下，純化二苯乙烯苷和Vc比較，吸光度越大，其還原力越強。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔吸附樹脂的篩選

依據(jù)1.3.4方法，將大孔吸附樹脂S-8、NKA-9、D101、D201、D301、AB-8、DM-130用于何首烏中二苯乙烯苷類物質(zhì)的靜態(tài)吸附-解吸實驗，實驗結(jié)果見表1。從實驗數(shù)據(jù)可知，不同種類樹脂的吸附率和解吸率不同。從吸附率的數(shù)據(jù)可以看出，NKA-9樹脂吸附率最高；從解吸率的數(shù)據(jù)可以看出，S-8樹脂解吸率最高，NKA-9樹脂次之，但兩者差別不大。從表1中數(shù)據(jù)綜合考慮吸附-解吸效果，NKA-9樹脂效果最好，因此選擇NKA-9樹脂對何首烏中二苯乙烯苷類物質(zhì)進行分離純化。

表1 吸附-解吸實驗結(jié)果

2.2 NKA-9大孔樹脂吸附實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以二苯乙烯苷上樣液濃度（A）、上樣速度（B）、上樣量（C）和乙醇濃度（D）四因素為變量，進行L9(34)正交試驗，方案設(shè)計見表2所示。

表2 因素水平表

以NKA-9大孔樹脂對二苯乙烯苷的吸附率為評價指標(biāo)，對上樣液濃度（A）、上樣速度（B）、上樣量（C）和乙醇濃度（D）進行正交實驗優(yōu)化，實驗結(jié)果見表3。

表3 正交實驗結(jié)果

從表3的極差分析可知，樹脂吸附效果的影響大小順序為：A＞C＞B＞D，即二苯乙烯苷上樣液濃度（A）對吸附率影響最大，其次是上樣量（C）和上樣速度（B），最后是乙醇濃度（D）。由k值得出NKA-9大孔樹脂對二苯乙烯苷的最佳吸附條件為：A2B2C2D1，即上樣液濃度為3.5 mg/mL、上樣速度為3.0 BV/h、上樣量為3.0 BV和乙醇濃度70%。

2.3 NKA-9大孔樹脂解吸實驗

在二苯乙烯苷解吸過程中，首先用石油醚和乙酸乙酯混合液（體積比2∶1）洗脫，除掉二苯乙烯苷粗提物中的極性較小的揮發(fā)油、脂類和色素等，再用無水乙醇以流速3.0 BV/h洗脫，TLC監(jiān)測，按BV收集洗脫液，按1.3.1方法測定各段洗脫液二苯乙烯苷的含量（mg/mL），得到解析曲線，實驗結(jié)果圖2所示。

由圖2可知，在收集的各段洗脫液中，隨著洗脫液體積的增加，二苯乙烯苷的含量先增加再降低，到第4BV洗脫液時，二苯乙烯苷已基本洗脫完全，因此可以確定選用洗脫液用量為4BV進行解吸。

圖2 大孔樹脂解吸曲線

2.4 清除羥基自由基（·OH）作用

以純化二苯乙烯苷和Vc對羥基自由基（·OH）的清除作用比較，設(shè)計對比實驗，其實驗結(jié)果如圖3所示。

圖3 二苯乙烯苷和Vc對·OH的清除能力

由圖3可知，在所選實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，純化二苯乙烯苷和Vc隨著濃度的增加，清除羥基自由基（·OH）的能力不斷增強，當(dāng)濃度達到一定值時，清除率趨于穩(wěn)定。其中純化二苯乙烯苷濃度為35 mg/L時，純化二苯乙烯苷對·OH的清除率達到72.72%，說明純化二苯乙烯苷對羥基自由基（·OH）有較好的清除能力。

2.5 清除DPPH·作用

以純化二苯乙烯苷和Vc對DPPH·的清除作用比較，設(shè)計對比實驗，其實驗結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，在所選實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，純化二苯乙烯苷和Vc隨著濃度的增加，清除DPPH·的能力不斷增強，當(dāng)濃度達到一定值時，清除率趨于穩(wěn)定。其中純化二苯乙烯苷濃度為14 mg/L時，純化二苯乙烯苷對DPPH·的清除率達到78.73%，結(jié)果表明，純化二苯乙烯苷對DPPH·有較好的清除能力。

圖4 二苯乙烯苷和Vc對DPPH·的清除能力

2.6 還原力分析

一般而言，物質(zhì)的還原力與抗氧化能力之間具有相關(guān)性，物質(zhì)的抗氧化能力越強，還原力越強。以純化二苯乙烯苷和Vc對Fe3+的還原力比較，設(shè)計對比實驗，其實驗結(jié)果如圖5所示。

圖5 二苯乙烯苷和Vc的還原力

還原力測試實驗是根據(jù)Fe3+被還原為Fe2+，純化二苯乙烯苷和Vc還原六氰合鐵酸鉀后，生成普魯士藍，在700 nm處出現(xiàn)最大吸收。由圖5可知，在所選實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，純化二苯乙烯苷和Vc的還原力隨著濃度的增加而增大，在相同濃度條件下，純化二苯乙烯苷的還原力約為Vc的40%，雖然純化二苯乙烯苷的吸光度值低于Vc，但純化二苯乙烯苷也表現(xiàn)出了較強的還原力。

3 結(jié)論

本實驗通過超聲波提取技術(shù)，從何首烏中提取得到了二苯乙烯苷類物質(zhì)，提取率為7.83%，粗提物二苯乙烯苷類物質(zhì)純度為34.62%。通過對大孔吸附樹脂的吸附-解吸實驗考察，篩選出了效果最佳的NKA-9樹脂；采用石油醚、乙酸乙酯和無水乙醇對何首烏二苯乙烯苷類物質(zhì)粗提物進行梯度洗脫，TLC監(jiān)測，制備得到純化二苯乙烯苷類化合物，純度為72.68%。通過純化二苯乙烯苷類化合物與Vc抗氧化活性和還原力比較研究，二苯乙烯苷類物質(zhì)對·OH和DPPH·的清除率分別達到72.72%和78.73%，還原力約為同濃度Vc的40%，實驗結(jié)果表明，何首烏中二苯乙烯苷類物質(zhì)具有較好的抗氧化活性和較強的還原能力。