魏琪，陳品澔，楊瀅，李佳妮

（西安培華學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，陜西西安 710125）

皮膚是機(jī)體的第一道防線(xiàn)，當(dāng)皮膚創(chuàng)傷、燒傷等后面臨著皮膚創(chuàng)面的修復(fù)，包括止血、消炎、細(xì)胞增殖和遷移等[1]，而傳統(tǒng)的生物敷料比如紗布僅僅保護(hù)傷口、暫時(shí)止血的作用，顯然已達(dá)不到社會(huì)的需求。近些年，研究者們往往在生物敷料中融合一些生長(zhǎng)因子用于缺損修復(fù)[2]，bFGF在眾生長(zhǎng)因子中研究相對(duì)比較深入。Shuichi Ogino等[3]將bFGF注入cgs（膠原蛋白/明膠海綿），植入小鼠背部的全厚皮膚缺陷，結(jié)果顯示促進(jìn)了真皮樣組織的形成；Sakamoto等[4]利用1%的戊二醛交聯(lián)明膠與bFGF，并將交聯(lián)液作用于小鼠的缺損皮膚，結(jié)果表明交聯(lián)液有效地促進(jìn)小鼠缺損皮膚的修復(fù)。在眾多敷料材料中，絲素蛋白作為天然結(jié)構(gòu)蛋白，有利于細(xì)胞貼附和伸展，易提取且提取量大等優(yōu)點(diǎn)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域備受青睞[5]。比如，Tony M. D等通過(guò)J將絲素蛋白與神經(jīng)生長(zhǎng)因子（Nerve growth factor,NGF）、睫狀神經(jīng)生長(zhǎng)因子（ciliary neurotrophic factor, CNTF）共紡形成納米纖維膜，卷曲形成3D支架，將大鼠的原代神經(jīng)細(xì)胞種植其上，突起的長(zhǎng)度明顯增長(zhǎng)?？梢?jiàn)，絲素蛋白材料可被設(shè)計(jì)并融合生長(zhǎng)因子用于皮膚缺損的修復(fù)。2016年，筆者將ELP50-bFGF（類(lèi)彈性蛋白ELP50與bFGF的融合蛋白）與絲素蛋白按比例凍干形成復(fù)合膜片用于小鼠皮膚缺損的修復(fù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)復(fù)合膜片中bFGF并未表現(xiàn)出活性，可能ELP50的結(jié)構(gòu)影響了bFGF的結(jié)構(gòu)使其失活。因此，本實(shí)驗(yàn)擬改進(jìn)方法通過(guò)靜電紡絲制備SF/bFGF納米纖維膜，以期促進(jìn)皮膚缺損的修復(fù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4周齡的昆明小鼠，由西安培華學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試劑

戊巴比妥鈉（Sigma）、BCATM蛋白檢測(cè)試劑盒（Thermo）、胰酶（Hyclone）、DMEM（Gibco）、非必需氨基酸（Hyclone）、PBS（Hyclone）、胎牛血清（FBS,Gibco）、Na2S（天津天力），其他試劑均為分析純?cè)噭?/p>

1.3 儀器

冷凍式干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）、倒置顯微鏡（NikonBinder）、真空干燥箱（Vacucell 22L, MMM）、掃描電子顯微鏡（SEM，飛利浦）、超凈臺(tái)（海爾）等。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

（1）絲素蛋白的制備。切割蠶繭，干燥并稱(chēng)重10 g，置于含有2 L Na2CO3（濃度0.05 mol/L）水溶液的鍋中，脫膠30 min，蒸餾水多次洗滌，脫膠反復(fù)進(jìn)行3次后在100 ℃烘箱中烘干，用9.3 mol/L LiBr在80℃水浴中溶解絲素蛋白，以轉(zhuǎn)速為10 000 r/min的速度離心10 min用于除去懸浮雜質(zhì)，最后裝入透析袋透析3 d，凍干機(jī)凍干保存。

（2）SF/bFGF納米纖維膜的制備。將SF凍干品加入雙蒸水配成濃度為25%的溶液，加入bFGF，使bFGF的濃度為10 μg/mL，設(shè)置距接收屏的距離為7 cm及電壓為20 kV/cm，進(jìn)行靜電紡絲獲得SF/bFGF納米纖維膜。

（3）遷移實(shí)驗(yàn)。使用無(wú)菌的12孔板，用記號(hào)筆在每個(gè)孔背面均勻的畫(huà)線(xiàn)，向每個(gè)孔中各放入一個(gè)蓋玻片后各加入1 mL混合蛋白溶液（bFGF的濃度為10 μg/mL，SF的濃度為25%）進(jìn)行包被。次日，向每個(gè)孔內(nèi)各種5×105個(gè)L929細(xì)胞，等細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)整個(gè)孔后用槍頭沿著記號(hào)筆的橫線(xiàn)劃痕，在0 d和3 d，借助顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)并觀察遷移的數(shù)量和距離。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，各孔加入等量PBS組作為陰性對(duì)照組。

（4）昆明小鼠皮膚缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)使用麻醉劑戊巴比妥鈉事先麻醉小鼠，脫毛劑脫毛后，在背部中央消毒部位制造直徑約1.2 cm的圓形缺損，將直徑也為1.2 cm的SF/bFGF納米纖維膜和SF膜各貼于昆明小鼠皮膚缺損部位，無(wú)貼附組即con組，每組包含6只小鼠，每天采照并計(jì)算傷口的愈合面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合膜片的形態(tài)結(jié)構(gòu)

SF和bFGF混合溶液靜電紡絲得到的纖維如圖1所示，設(shè)置濃度SF為25%，bFGF為10 μg/mL、距接收屏的距離為7 cm及電壓為20 kV/cm，纖維形貌比較均一和規(guī)則，粗細(xì)相對(duì)一致，可見(jiàn)少量串珠和液滴的存在。

圖1 靜電紡絲納米纖維膜形態(tài)

2.2 SF/bFGF對(duì)L929遷移能力的影響

L929遷移結(jié)果如圖2所示，0d時(shí)，L929剛好長(zhǎng)滿(mǎn)各孔，長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)良且形狀如長(zhǎng)梭，劃痕區(qū)都可見(jiàn)少量L929；3 d時(shí)，SF/bFGF組比對(duì)照組有更多的L929從劃痕區(qū)外遷至劃痕區(qū)內(nèi)且距離也較長(zhǎng)，此時(shí)各孔L929長(zhǎng)勢(shì)稍弱，細(xì)胞中央漸漸突起，導(dǎo)致形狀由長(zhǎng)梭漸漸變成短梭。

圖2 劃痕區(qū)L929遷移觀察

3.3 小鼠皮膚缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

小鼠膚缺損的修復(fù)情況如圖3所示，實(shí)驗(yàn)組將SF/bFGF納米纖維膜和SF膜貼于小鼠的缺損部位，Con組不做任何處理。從第0 d到第18 d各組小鼠都陸續(xù)在修復(fù)，但修復(fù)速度不同，0 d時(shí)，纖維膜都牢牢的貼于缺損部位無(wú)需外力作用且有效的阻擋了血液的滲出；從第6 d到第18 d明顯看出SF/bFGF組小鼠缺損面積減小的快，到第18 d幾乎修復(fù)完成，SF組和Con組未修復(fù)完成。

圖3 小鼠皮膚缺損修復(fù)的大體觀察

3 討論

SF與bFGF混紡獲得SF/bFGF納米纖維膜，結(jié)果顯示纖維間有黏連推測(cè)復(fù)合膜片結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，力學(xué)性能較好，SF/bFGF納米纖維膜是一種相對(duì)較好的載體材料。L929的遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SF/bFGF組比對(duì)照組細(xì)胞遷移的數(shù)量明顯多且距離遠(yuǎn)，說(shuō)明將SF/bFGF包被于培養(yǎng)皿底能有效促進(jìn)細(xì)胞的遷移且表現(xiàn)出了bFGF的活性。小鼠皮膚缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)大體結(jié)果顯示，SF/bFGF和SF均能促進(jìn)小鼠皮膚缺損修復(fù)，SF/bFGF尤為明顯，雖然Con組各小鼠到第6天的修復(fù)面積標(biāo)準(zhǔn)偏差較其他組大，不影響整體修復(fù)結(jié)果。整體結(jié)果說(shuō)明通過(guò)靜電紡絲獲得的SF/bFGF納米纖維膜表現(xiàn)出了bFGF的天然活性，也說(shuō)明以絲素蛋白作可作為bFGF的承載材料。