趙金博，肖依林，王柳依，楊萌，彭海燕，程鵬飛

（北京師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院水環(huán)境模擬國家重點實驗室，北京100875）

重金屬多具有不可降解性，進(jìn)入土壤之后能夠長久存在，因此對土壤質(zhì)量造成了嚴(yán)重的威脅。隨著科學(xué)技術(shù)的急速發(fā)展，工業(yè)生產(chǎn)得到了大規(guī)模的擴(kuò)張，因而促進(jìn)了礦產(chǎn)資源的大量開發(fā)利用。與此同時，農(nóng)業(yè)的發(fā)展使得各種農(nóng)藥及化肥得到了更為頻繁的使用，含重金屬的污染物由此進(jìn)入環(huán)境，造成土壤污染日益嚴(yán)重。目前，世界各國土壤存在不同程度的污染，全世界平均每年排放Hg約1.5萬噸、Cu約340萬噸、Pb約500萬噸、Mn約1500萬噸、Ni約100萬噸[1]。重金屬污染物不能被化學(xué)或生物降解、易通過食物鏈途徑在生物體內(nèi)積累，毒性大，對生態(tài)環(huán)境、食品安全和人體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[2-4]。正因如此，土壤重金屬污染修復(fù)技術(shù)已成為研究熱點。

目前，重金屬污染土壤的修復(fù)技術(shù)研究取得了長足發(fā)展，主要包括物理、化學(xué)、生物、農(nóng)業(yè)生態(tài)和聯(lián)合修復(fù)技術(shù)。土壤淋洗技術(shù)是將水或含有沖洗助劑的螯合劑（檸檬酸、EDTA、DTPA、EDDS）、酸/堿溶液、表面活性劑等淋洗劑注入到土壤或沉積物中，洗脫和清洗土壤中污染物的過程[5-6]。化學(xué)螯合劑能夠活化土壤中存在的重金屬，以促進(jìn)植物的富集，進(jìn)而強(qiáng)化植物對土壤中重金屬的吸收[7-8]。EDTA是一種在土壤重金屬污染治理中應(yīng)用較廣且效果較佳的絡(luò)合劑，其原理是EDTA能夠與重金屬結(jié)合成一種具有較強(qiáng)結(jié)合力的絡(luò)合物，這種結(jié)合力大于土-重金屬間的結(jié)合力，進(jìn)而通過土液分離的方法將其從土壤中分離出來達(dá)到去除重金屬的目的[9]。EDTA對微生物群落豐富度的影響已有文獻(xiàn)報道[2-4]，王學(xué)峰等[14]的研究表明，EDTA處理的植物葉片在1周后有失綠、黃化等中毒癥狀發(fā)生，四川黃芥地上部和根部的干重相對于對照處理均有顯著降低，生長受到明顯的抑制，其生物量隨EDTA濃度的增加持續(xù)下降。史鼎鼎等[15]研究了EDTA處理對黑麥草生物量的影響，發(fā)現(xiàn)抑制了黑麥草生長，隨著Pb、Cd濃度的提高，EDTA處理的黑麥草總生物量提高，但其對黑麥草根系的損害更為顯著。

自然界中的土壤本身并不含有EDTA的成分，即便是被重金屬嚴(yán)重污染的土壤中也是同樣。EDTA的使用在去除土壤中重金屬的同時，其殘留液可能也對土壤生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生影響。為此，本文主要針對EDTA殘留液濃度與土壤微生物生長之間的關(guān)系進(jìn)行定性與定量分析。為EDTA在土壤殘留液的濃度對微生物群落的影響提供數(shù)據(jù)支撐。

2 材料與方法

2.1 實驗設(shè)計

用不同濃度梯度的EDTA處理土壤，懸濁液中的微生物培養(yǎng)，并對微生物的總量進(jìn)行計數(shù)，同時比較不同微生物之間的數(shù)量差異。對EDTA處理后的懸濁液理化性質(zhì)進(jìn)行測定，探究EDTA對微生物數(shù)目的影響。

本實驗土壤樣品為室內(nèi)花盆土壤，土壤中重金屬含量不詳。過篩后分為5份，分別加入無菌水、5mmol/L EDTA溶液、10mmol/L EDTA溶液、50mmol/L EDTA溶液、100mmol/L EDTA溶液浸泡48h模擬EDTA處理后的土壤。之后各組濃度的懸濁液分別接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基中，每個實驗組均設(shè)置3個平行樣，以減小實驗誤差。在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后用顯微鏡觀察平板上的菌落類別，對于其中菌落形態(tài)明顯不同的各微生物分別在顯微鏡下觀察以確認(rèn)差異。對于難以區(qū)別形態(tài)（微生物的細(xì)胞群體過于密集或細(xì)胞太小）的對象，采用格蘭氏染色進(jìn)行定性的區(qū)分；同時在液體培養(yǎng)基上用流式細(xì)胞儀對培養(yǎng)基內(nèi)所有微生物進(jìn)行計數(shù)，并且多次計數(shù)以探究不同濃度對于微生物整體數(shù)量的影響。

2.2 實驗材料

本次實驗應(yīng)用到微生物培養(yǎng)操作。培養(yǎng)時使用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，恒溫箱設(shè)定溫度為37℃。實驗使用EDTA處理土壤，濃度依次為0、5mg/L、10mg/L、50mg/L、100mg/L。革蘭氏染色材料包括結(jié)晶紫染液、碘液、酒精及沙黃染液。依實驗室內(nèi)試劑濃度。

3 結(jié)果與討論

隨著EDTA濃度的增加，在平板上可以觀察到的微生物種類由無菌水的7種降至100mmol/L的3種，直觀得到了EDTA的濃度會對微生物種類造成影響的定性分析結(jié)果（圖1）。即菌落數(shù)總體上隨著EDTA溶液濃度的增大而減少，其中，在50mmol/L和100mol/L EDTA濃度下菌落的數(shù)目有明顯減少。部分菌落在濃度為50mmol/L及以上的EDTA溶液中消失。然而在0～10mmol/L濃度直接微生物群落沒有明顯變化。以下是各個濃度不同種菌落在40倍光學(xué)顯微鏡下的圖像，由于技術(shù)條件的限制，未能觀察到不同EDTA溶液濃度下細(xì)胞的具體形態(tài)，因此，不同濃度的EDTA溶液對土壤微生物細(xì)胞的形態(tài)特征是否有影響還有待進(jìn)一步研究。

圖1 微生物生長狀況

通過PI染色法用流式細(xì)胞儀計數(shù)分析不同EDTA濃度處理下土壤中微生物死亡數(shù)目統(tǒng)計結(jié)果如圖2所示，依次為：對照組（A）、5mmol/L EDTA溶 液（B）、10mmol/L EDTA溶 液（C）、50mmol/L EDTA溶液（D）、100mmol/L EDTA溶液（E）。實驗結(jié)果表明，在0～5mmol/L，土壤微生物的存活個數(shù)分別為45850和46737（圖2，絕對計數(shù)值），死亡比均為0.08%，說明對照組與5mmol/L EDTA對土壤微生物總量影響不大。隨著EDTA溶液濃度的增加略有上升，微生物總數(shù)死亡比略有上升，達(dá)到10mmol/L的29%與50mmol/L的35%；然而當(dāng)EDTA濃度達(dá)到100mmol/L時，土壤微生物的死亡比值達(dá)到73%（見圖3）。經(jīng)過線性關(guān)系分析后得出，EDTA濃度與細(xì)菌死亡比的關(guān)系式為Y=0.1563X-0.1615（r2=0.87），結(jié)果表明，土壤中的EDTA濃度與土壤中微生物死亡數(shù)目呈現(xiàn)出正相關(guān)性。

圖2 流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析

圖3 不同濃度EDTA對微生物死亡比的影響

3 總結(jié)

本實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)土壤EDTA殘留液低于5mmol/L時，48h培養(yǎng)實驗并未發(fā)現(xiàn)微生物種類明顯減少，活體微生物總個數(shù)與對照組相近，證明EDTA對土壤微生物幾乎沒有影響；當(dāng)土壤EDTA殘留液高于10mmol/L時，土壤殘留液中EDTA是對土壤微生物生物多樣性有抑制作用，且濃度越高，微生物的生物多樣性明顯降低，總?cè)郝鋫€數(shù)死亡數(shù)目也逐漸升高。通過線性回歸發(fā)現(xiàn)土壤中的EDTA濃度與土壤中微生物死亡數(shù)目呈現(xiàn)出正相關(guān)性。本文證明EDTA雖能去除土壤中的重金屬成分，但對土壤微生物環(huán)境也有整體上的影響，進(jìn)而影響到整個土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定。因此EDTA在應(yīng)用于土壤修復(fù)中應(yīng)該注意控制其土壤殘留液濃度小于5mmol/L，此濃度下可降低其對微生物的影響。