俞秋華，付喜梅，劉莉莉，楊寧

（四川省疾病預(yù)防控制中心，四川成都 610000）

手部消毒是預(yù)防致病菌傳播的簡(jiǎn)單又有效的方法，因此，研究者們積極研發(fā)各種不同配方成分和含量的相關(guān)消毒劑，其中，三氯羥基二苯醚（2,4,4'-三氯-2'-羥基二苯醚，又稱三氯生）是一種高效的廣譜抗菌劑。手部消毒劑的形式多種多樣，隨著時(shí)代的進(jìn)步，使用要求的全面提高，免洗手凝膠逐漸出現(xiàn)。某免洗消毒凝膠為無(wú)色透明凝膠狀液體，其中乙醇平均含量為61.6%（V/V），三氯羥基二苯醚平均含量為0.88%（V/V），pH均值為6.0。本研究經(jīng)由實(shí)驗(yàn)室消毒試驗(yàn)和現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)，全面評(píng)價(jià)該免洗消毒凝膠的消毒效果、安全性和使用舒適度，研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 消毒液

某品牌免洗手消毒凝膠，原液備用。

1.1.2 試驗(yàn)菌株

大腸桿菌（8099）、金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、白色念珠菌（ATCC10231），由中國(guó)普通微生物菌種保藏中心提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

胰蛋白胨大豆瓊脂、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、沙氏瓊脂。

1.1.4 中和劑

含0.5%硫代硫酸鈉、0.5%卵磷脂、1.0%甘氨酸、3.0%吐溫-80的PBS溶液。

1.1.5 采樣液

含0.1%吐溫-80的PBS緩沖液。

1.1.6 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠，四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（川）2013-19.SPF級(jí)；健康大耳白兔，四川省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專委會(huì)養(yǎng)殖場(chǎng)提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK[川]2013-14.普通級(jí)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 殺菌試驗(yàn)方法[1]1.2.1.1 菌懸液的制備

用TSB分別洗下大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上經(jīng)過18 h培養(yǎng)的菌苔，混勻成菌懸液。用菌懸液制作菌片，晾干后使每片含菌量為 5.0×105～ 5.0×106。

1.2.1.2 中和劑載體定量鑒定試驗(yàn)

按載體浸泡定量殺菌試驗(yàn)的程序進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)3次重復(fù)均符合《消毒技術(shù)規(guī)范》（2002年版）的要求，則中和劑的成分及其濃度都合格。

1.2.1.3 載體浸泡定量殺菌試驗(yàn)

將各菌片投入5.0 mL消毒液中（陽(yáng)性對(duì)照組用PBS代替消毒液），分別作用至0.5 min、1.0 min、1.5 min時(shí)，無(wú)菌操作取出菌片投入中和劑試管內(nèi)，用手振敲80次，等待10 min，再混勻后，分別接種平皿，計(jì)數(shù)。試驗(yàn)中使用的中和劑等試劑、培養(yǎng)基，接種平皿做陰性對(duì)照，分別計(jì)算各菌在各作用時(shí)間的殺滅對(duì)數(shù)值。

1.2.1.4 現(xiàn)場(chǎng)消毒試驗(yàn)

選擇30名手部未經(jīng)處理的同事為受試者，雙手互相揉搓以均勻所帶自然菌的數(shù)量，左手手指并攏，用無(wú)菌棉簽蘸取稀釋液，擠干，往返涂擦所有手指部位2遍，期間轉(zhuǎn)動(dòng)1次棉簽，無(wú)菌條件下將棉簽前段剪入中和劑管，充分混勻后接種平皿，計(jì)數(shù)，做陽(yáng)性對(duì)照。按免洗手凝膠的說明書上的使用方法對(duì)右手消毒1.0 min后，用無(wú)菌棉簽蘸取中和劑進(jìn)行采樣，接種平皿，計(jì)數(shù)，做試驗(yàn)組。

1.2.2 毒性試驗(yàn)[1]

1.2.2.1 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

取小鼠雌雄各半，禁食一晚，不禁水。采用一次最大限度試驗(yàn)，劑量為5 000 mg/kg，稱取5.0 g樣品加蒸餾水至20 mL混勻后備用，給藥量按20 mL/kg體重計(jì)算，用灌胃方式將樣品一次給予動(dòng)物。觀察小鼠的中毒癥狀，死亡只數(shù)，連續(xù)14天，計(jì)算半數(shù)致死劑量LD50。

1.2.2.2 家兔多次完整皮膚刺激試驗(yàn)

取兔子雌雄各兩只，試驗(yàn)前在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)3天。提前24 h將背毛剃掉，將凝膠0.5 mL涂于脊柱一側(cè)2.5 cm×2.5 cm范圍的皮膚上，另一側(cè)作空白對(duì)照。涂抹4 h后除靜凝膠的殘留。重復(fù)涂抹14天，每天1次，觀察結(jié)果。

1.2.2.3 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)

取小鼠雌雄各半，分為樣品1 250 mg/kg、2 500 mg/kg、5 000 mg/kg三個(gè)劑量組，以及陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組。分別稱取1.25 g、2.5 g、5.0 g樣品和40 mg環(huán)磷酰胺，分別加蒸餾水至20 mL混勻后備用，經(jīng)口灌胃。兩次染毒間隔24 h，第二次染毒后6 h處死小鼠，取胸骨髓涂片，姬姆薩應(yīng)用液染色。每只小鼠在油鏡下選擇細(xì)胞著色適當(dāng)?shù)膮^(qū)域，計(jì)數(shù)1 000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞中出現(xiàn)的含有微核的細(xì)胞的個(gè)數(shù)，計(jì)算嗜多染紅細(xì)胞與正染紅細(xì)胞的比例（PCE/NCE）。

2 結(jié)果與分析

2.1 中和劑鑒定試驗(yàn)

試驗(yàn)表明，含0.5%硫代硫酸鈉、0.5%卵磷脂、1.0%甘氨酸、3.0%吐溫-80的PBS溶液可中和該消毒液原有液中含有的殺菌成分，且該中和劑及中和產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌、白色念珠菌及培養(yǎng)基無(wú)明顯影響，詳見表1。

表1 中和劑鑒定結(jié)果

2.2 殺菌試驗(yàn)結(jié)果

該免洗手消毒凝膠對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌分別作用0.5 min，殺滅對(duì)數(shù)值均＞3.0，詳見表2。

2.3 現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)結(jié)果

該免洗手消毒凝膠對(duì)手作用1.0 min平均殺滅對(duì)數(shù)值為1.50，達(dá)到消毒合格要求。

2.4 毒性試驗(yàn)

2.4.1 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果

小鼠無(wú)死亡發(fā)生，該免洗手消毒凝膠對(duì)小鼠雌、雄性口服LD50均大于5 000 mg/kg體重，屬于實(shí)際無(wú)毒，詳見表3。

2.4.2 多次完整皮膚刺激試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)中有4只兔皮膚出現(xiàn)紅斑等炎性反應(yīng)，平均每天每只兔刺激反應(yīng)評(píng)分均值為0.89，分級(jí)結(jié)果定為輕刺激性，詳見表4。

表2 免洗手消毒凝膠對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌的殺滅效果

表3 免洗手消毒凝膠對(duì)小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果

表4 免洗手消毒凝膠對(duì)兔多次完整皮膚刺激試驗(yàn)結(jié)果

2.4.3 小鼠骨髓多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果

微核率差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，PCE/NCE大于0.1，陽(yáng)性組顯著高于陰性組。證實(shí)該免洗手消毒凝膠對(duì)小鼠無(wú)染色體損傷作用。詳見表5。

3 討論

本免洗手消毒凝膠對(duì)細(xì)菌的繁殖體以及真菌均具有很好的殺滅作用，對(duì)自然菌也有很好的殺滅作用，作用非常迅速，消毒效果好，達(dá)到消毒技術(shù)規(guī)范對(duì)消毒液消毒效果的要求，毒性屬于實(shí)際無(wú)毒，輕皮膚刺激性，無(wú)染色體損傷作用。

經(jīng)研究，三氯羥基二苯醚和乙醇含量分別為 0.24%、56%[2]，1 100 mg/L、52.8%[3]，1.55%、39.6%[4]，2 690 mg/L、78.7%[5]，12.20 g/L、39.70%[6]，2 690 mg/L、65.0%的手消毒劑[7]，進(jìn)行載體浸泡定量殺菌試驗(yàn)，僅0.5 min對(duì)各菌就已能達(dá)到消毒合格的要求。但含3 750 mg/L三氯羥基二苯醚和體積分?jǐn)?shù)33%乙醇的消毒液作用0.5 min時(shí)對(duì)銅綠假單胞菌的平均殺滅對(duì)數(shù)值僅達(dá)到2.41[8]，作用1 min時(shí)方可達(dá)到對(duì)其消毒合格；也有研究指出，含乙醇75.4%的消毒劑對(duì)銅綠假單胞菌的殺滅作用優(yōu)于含0.18%的三氯生[9]；總結(jié)對(duì)比可以看出，雖然手消毒液所含三氯羥基二苯醚含量低于1 100 mg/L和乙醇的含量低于33%則會(huì)略微影響其進(jìn)行殺菌的效果和速度，但是，在此含量之上，所含此兩種成分的濃度高低不同并不會(huì)影響到消毒液實(shí)際的殺菌效果和殺菌速度。

表5 免洗手消毒凝膠對(duì)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果

乙醇對(duì)皮膚有脫脂作用，會(huì)讓大部分使用者覺得皮膚干燥，免洗手消毒液做成此研究中使用時(shí)感覺濕潤(rùn)的凝膠狀，會(huì)讓使用者更加舒適，人群接受度更高。其與聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽、葡萄糖酸洗必泰、醋酸氯已定、復(fù)合碘復(fù)配時(shí)均出現(xiàn)皮膚發(fā)紅等不良反應(yīng)的報(bào)告[10]，與三氯生復(fù)配則不容易出現(xiàn)皮膚過敏[11]。但有報(bào)告指出，三氯羥基二苯醚會(huì)使水生生物處于有潛在風(fēng)險(xiǎn)的環(huán)境中[12]，可以通過多種途徑進(jìn)入到環(huán)境介質(zhì)中[13]，而且對(duì)生態(tài)環(huán)境、生物發(fā)育也具有潛在的毒性效應(yīng)[14]，人體還是應(yīng)避免大劑量的長(zhǎng)期重復(fù)接觸[15]。本試驗(yàn)研究結(jié)果也證實(shí)此配方對(duì)皮膚還是存在有輕度的刺激，且具有刺激性氣味。

綜上所述，建議研發(fā)者在可以在保證殺菌效果的前提下，盡量降低乙醇和三氯羥基二苯醚這兩種主要有效消毒成分的含量，既減小其生產(chǎn)成本、降低對(duì)皮膚的刺激程度，使人群接受度更高，又降低對(duì)生態(tài)和環(huán)境可能造成的潛在影響和污染；或致力于研發(fā)比以上各配方成分對(duì)人體、皮膚刺激性更小，同時(shí)對(duì)環(huán)境影響也更小的新配方成分。