張志康，閆靜靜，趙鵬，程顯好

（魯東大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山東煙臺(tái) 264025）

魚(yú)、蝦、貝、藻等海產(chǎn)品中所含的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)及維生素是陸生生物所不能比擬的，海洋生物中含有大量對(duì)人體有益的生物活性物質(zhì)。甲殼素是海洋生物中含量豐富且具有重要生物活性的一種天然多糖，甲殼素及其衍生物已在許多領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用，尤其是在醫(yī)療和藥物制劑方面。另外，甲殼素作為功能性健康食品，具有明顯的抗癌、降血脂和降血壓的作用[1-3]。

人們通常只關(guān)注利用海產(chǎn)品本身的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，往往忽視了對(duì)生產(chǎn)中殘留的蝦貝殼的處理，從而對(duì)周邊環(huán)境及海域造成了嚴(yán)重的污染，影響其他養(yǎng)殖業(yè)和沿海旅游業(yè)的發(fā)展。崆峒島是一個(gè)盛產(chǎn)海產(chǎn)品的島嶼，尤其以扇貝生產(chǎn)為主，但由于扇貝殼沒(méi)有采用合適的方法處理而長(zhǎng)年累月地堆積在沿海地帶，每到夏秋季節(jié)，堆積扇貝殼的區(qū)域就會(huì)散發(fā)出刺鼻的臭味，不僅使崆峒島空氣質(zhì)量受到影響，也使其旅游業(yè)受到極大影響。因此，選擇一個(gè)能夠盡快處理扇貝殼，降低島嶼環(huán)境污染的方法迫在眉睫。

本研究通過(guò)從扇貝殼堆積場(chǎng)取樣，經(jīng)過(guò)梯度稀釋、平板涂布、平板劃線、產(chǎn)酶菌初篩、復(fù)篩等步驟篩選出高產(chǎn)蛋白酶的菌株，利用微生物產(chǎn)生的蛋白酶對(duì)扇貝殼內(nèi)剩余的蛋白質(zhì)進(jìn)行初步分解，避免了腐敗氣味的產(chǎn)生，保護(hù)了環(huán)境。與此同時(shí)，扇貝殼含有豐富的鈣質(zhì)，也可以被進(jìn)一步被利用，從而帶動(dòng)周邊經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

山東省煙臺(tái)市崆峒島扇貝殼堆積場(chǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

超凈工作臺(tái)（蘇州安泰）、壓力蒸汽滅菌器（上海醫(yī)用核子儀器廠）、生化培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）、電子天平（上海精科電子天平廠）、振蕩培養(yǎng)箱（哈爾濱東聯(lián)電子）、pH計(jì)（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）、TM-1000, Table top Microscope。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 斜面及平板培養(yǎng)基

高氏1號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g、KNO31 g、NaCl 0.5 g、Na2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO40.01 g、瓊脂18～ 20 g、H2O 1 000 mL，pH 7.2～ 7.4。

先用少量冷水將淀粉調(diào)成糊狀，在火上邊攪拌邊加水及其他成分，待全部溶化后補(bǔ)足水分至1 000 mL[4]。

1.3.2 篩選培養(yǎng)基

干酪素12 g、Na2HPO4·12H2O 3 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.16 g。

1.3.3 理化鑒定培養(yǎng)基

肉汁蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨5 g、瓊脂15～20 g、牛肉浸膏5 g、NaCl 5 g、H2O 1 000 mL，pH 7.2～7.4。

牛奶培養(yǎng)基：脫脂牛奶1 000 mL，分裝每管10 mL，105 ℃高壓滅菌30 min，培養(yǎng)放線菌后記錄培養(yǎng)基的外觀。

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基：馬鈴薯300 g、葡萄糖5 g、瓊脂20 g、自來(lái)水1 000 mL，pH 6.8。將馬鈴薯切成小方塊，加入200 mL水，在常壓下蒸45 min，浸汁用細(xì)紗布過(guò)濾，不要擠殘?jiān)Ｆ渌麪I(yíng)養(yǎng)物溶于150 mL水內(nèi)，然后加到馬鈴薯浸汁中，在常壓下蒸45 min，將此混合液加水到1 000 mL，標(biāo)定并過(guò)濾，然后加瓊脂。

淀粉溶液：可溶性淀粉20 g、K2HPO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KCl 0.5 g、KNO32 g、CaCO32 g、H2O 1 000 mL。將淀粉調(diào)成糊狀再加入沸水，將混合液用常壓蒸汽蒸1 h，即得澄清溶液。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨5 g、葡萄糖20 g、NaCl 5 g、瓊脂 15 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.2[5]。

1.4 蛋白酶產(chǎn)生菌的分離純化

1.4.1 制備土壤稀釋液

稱(chēng)取10.0 g碎的扇貝殼樣品，放入裝有90.0 mL無(wú)菌水的三角瓶中，得到10-1的稀釋液，然后用移液管取1.0 mL稀釋液于裝有9.0 mL無(wú)菌水的大試管內(nèi)，以次類(lèi)推，得到10-2～10-7不同稀釋倍數(shù)的稀釋液[6]。

1.4.2 涂布和培養(yǎng)

分別取10-5、10-6、10-7稀釋濃度的樣品0.2 mL涂布于蛋白酶產(chǎn)生菌選擇培養(yǎng)基，每個(gè)濃度涂布3個(gè)平皿，置于30 ℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)48 h。

1.4.3 觀察與保存

培養(yǎng)2 d、3 d、4 d后，用牙簽挑取菌落形態(tài)和顏色不一致的菌體點(diǎn)種于酪蛋白鑒別培養(yǎng)基上，置于30 ℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)48 h。然后將有透明圈產(chǎn)生的菌株接種于斜面培養(yǎng)基中，放在冰箱中保存待用。

1.5 產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選

將所得到的試管斜面菌株采用平板劃線分離法接種于酪蛋白鑒別培養(yǎng)基上，既達(dá)到分離純化的目的，又起到鑒別和篩選的作用。通過(guò)觀察水解圈的大小來(lái)判斷產(chǎn)酶能力的高低，挑取水解圈大的菌落再次接種于斜面培養(yǎng)基上，放在冰箱中保存待用[7-9]。

1.6 菌株鑒定

1.6.1 菌落形態(tài)觀察及理化鑒定

觀察記錄所篩菌株的生長(zhǎng)情況，包括菌落特征、菌體形態(tài)、菌絲形態(tài)、孢子形態(tài)等。

1.6.2 放線菌顯微觀察

利用插片法對(duì)所篩放線菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲、孢子形態(tài)進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

從扇貝堆積場(chǎng)采集4份樣品，應(yīng)用梯度稀釋法進(jìn)行培養(yǎng)，然后挑取30個(gè)單菌落于酪素選擇性平板上培養(yǎng)48 h，挑取水解圈直徑與菌落直徑比之大于2的菌落進(jìn)行斜面保藏。其中發(fā)現(xiàn)8株產(chǎn)酶較高，將這8株分別編號(hào)為SF1～SF8。結(jié)果見(jiàn)表1，圖1、圖2。

表1 扇貝殼堆積場(chǎng)產(chǎn)蛋白酶菌株菌落直徑和水解透明圈直徑

2.2 菌株鑒定

菌株（SF1、SF2、SF5、SF6）的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲、孢子絲觀察如圖3～6，表2。

圖1 SF1～4在酪素選擇性培養(yǎng)基上的透明圈

圖2 SF5～8在酪素選擇性培養(yǎng)基上的透明圈

圖3 SF1孢子絲（10 000倍掃描電鏡下觀察）

圖4 SF2氣生菌絲及孢子絲（10 000倍掃描電鏡下觀察）

圖5 SF5氣生菌絲及孢子絲（10 000倍掃描電鏡下觀察）

圖6 SF6氣生菌絲及孢子絲（10 000倍掃描電鏡下觀察）

2.3 菌落形態(tài)觀察及理化鑒定

菌株的生理生化特征如表3所示。

表2 扇貝殼堆積場(chǎng)產(chǎn)蛋白酶菌株菌絲及孢子絲形態(tài)特征

表3 菌株的生理生化特征

根據(jù)Bergery氏放線菌分類(lèi)手冊(cè)中菌落特征及生理生化特征，可初步鑒定菌株SF1為諾卡氏菌屬，SF2～SF8屬于鏈霉菌屬。諾卡氏菌屬和鏈霉菌屬相近，但一般不產(chǎn)生氣生菌絲體，且以盛產(chǎn)抗生素為名。鏈霉菌屬的種具有發(fā)育良好的菌絲體，但有的種在生長(zhǎng)后期氣生菌絲體會(huì)慢慢退化或者分裂產(chǎn)生孢子，菌絲體不形成橫隔膜，且一般具有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)分解能力。

3 討論

本研究從廢棄的扇貝殼中分離得到8株產(chǎn)蛋白酶的放線菌，由菌落特征及生理生化特征可初步鑒定放線菌SF1屬于諾卡氏菌屬，SF2～SF8屬于鏈霉菌屬。蛋白酶是一類(lèi)水解酶，在魚(yú)、肉加工工業(yè)廢水處理中已得到了廣泛應(yīng)用。通過(guò)產(chǎn)酶微生物發(fā)酵可得到相應(yīng)的酶制劑，該酶制劑應(yīng)用于崆峒島扇貝殼的處理中，可加快廢棄貝殼的處理過(guò)程，使崆峒島的環(huán)境得到一定程度的改善。

與國(guó)外相比，我國(guó)酶工程在環(huán)境污染治理方面的研究與開(kāi)發(fā)仍有較大差距，特別是在高產(chǎn)菌株的選育、酶制劑的制備工藝、產(chǎn)品質(zhì)量等方面。在固定化酶和固定化細(xì)胞的研究與開(kāi)發(fā)也需加強(qiáng)，并爭(zhēng)取能較廣泛地用于污染治理。

在基因工程、蛋白質(zhì)工程等方面，我國(guó)已開(kāi)展了改造酶、開(kāi)發(fā)新酶的研究、生物傳感器的研究，也取得一些進(jìn)展。利用酶制作的生物傳感器在環(huán)境污染監(jiān)測(cè)中應(yīng)用越來(lái)越廣泛，酶在廢物處理及資源化過(guò)程中正在發(fā)揮重要作用，利用基因工程和蛋白質(zhì)工程擴(kuò)展酶的代謝途經(jīng)，是治理難降解有毒污染物的重要方法[11-12]。