孫志藝，張 茹，趙麗萍，王彥多，劉金虎，李梓欣，史 磊

(山東中醫(yī)藥大學 藥學院，山東 濟南 250355)

全蝎為鉗蝎科東亞鉗蝎的干燥體，據(jù)臨床報道，全蝎對于治療肺癌、喉癌、食管癌、乳房腫瘤等多種癌腫有較好的療效，中國古代中醫(yī)文獻例如宋朝《開寶本草》、明朝《本草綱目》等也多處記載全蝎藥用價值極高[2]。焦方文[3]等人通過對全蝎酶解工藝研究發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶、胰凝蛋白酶和彈性蛋白酶作用較佳。張盼盼[1]等人發(fā)現(xiàn)全蝎酶解液80%乙醇沉淀物>10kDa分子量段對肺腺癌A549抑制率較高。Fangwen Jiao[4]等人發(fā)現(xiàn)酶解3h，pH值8.5，酶量2000U條件下全蝎酶解效果較好。本文通過優(yōu)化后酶解工藝得到全蝎復合酶酶解液，通過超濾選取>10kDa分子量段全蝎酶解液超濾物，對三種癌細胞體外抗腫瘤活性結(jié)果進行比較，為進一步研究全蝎酶解物超濾物的抗腫瘤作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 藥材

新鮮野生全蝎(購于山東沂源)經(jīng)山東中醫(yī)藥大學中藥鑒定學教研室李峰教授鑒定為東亞鉗蝎，選擇成年鉗蝎，洗凈后-20℃冷凍過夜，低溫勻漿后冷凍干燥成粉末備用。

1.2 儀器與試藥

KQ-500E型超聲波提取器(昆山市超聲儀器有限公司)；LGJ-18A型冷凍干燥機(北京四環(huán)科學儀器廠有限公司)；WT600-2J型超濾儀(上海摩速科學器材有限公司)； 生物安全柜(上海力申科學儀器有限公司)；TD5M 型臺式離心機(長沙湘智離心機儀器有限公司)；2D2X-50FBS立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)； BBD6 型二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Scientific)； MK3 型酶標儀(Thermo Scientific)；CKX41型倒置顯微鏡(Olympus)；牛血清蛋白(BR)； 1640 細胞培養(yǎng)基(Hylcone-賽默飛世爾生物制品北京有限公司)；Folin-酚試劑(國藥集團化學試劑有限公司)；胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶(上海源葉生物科技有限公司)；MTT；DMSO等。喉癌Hep-2、肺腺癌A549、乳腺癌MCF-7由山東省立醫(yī)院提供。

2 方法

2.1 全蝎酶解液超濾物提取

根據(jù)張盼盼[1]等人得提取方法制備酶解液，用0.8微米濾膜過濾，通過10kDa濾膜超濾得到>10kDa分子量段的物質(zhì)，冷凍干燥備用。

2.2 細胞培養(yǎng)(肺腺癌A549、喉癌Hep-2、乳腺癌MCF-7)

2.2.1 細胞復蘇

從液氮罐中將三種凍存的腫瘤細胞取出，分別將其放置于37 ℃ 的水浴鍋中融化。進行消毒，然后將其帶入超凈臺中，取出細胞，以1000 r/min進行離心。之后向離心管中加入1640 培養(yǎng)基(A549細胞采用DMEM培養(yǎng)基)，通過吹打使其混合均勻，隨后將其轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，添加適量的1640培養(yǎng)基，放置24 h 換液。

2.2.2 細胞傳代

待細胞增殖至90 %左右時，進行細胞傳代。首先用PBS緩沖溶液將其清洗三次，再加入500μL 0.25 % 的胰蛋白酶溶液消化。將培養(yǎng)瓶放置于超凈臺中，靜置一段時間，待細胞為蜷縮不貼壁后加入1640培養(yǎng)基，輕輕吹打，吹散成單細胞懸液狀態(tài)，將細胞分裝至培養(yǎng)瓶中。最后放置于含5% CO2、適宜濕度、溫度為37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并于24 h 后換液。

2.3 抑制率測定(MTT法)

2.3.1 提取物溶液配制

精密稱取質(zhì)量為10.00 mg的全蝎復合酶酶解液>10KDa分子量段超濾物凍干粉，并溶解于5 mL的1640培養(yǎng)基中，配成含凍干粉2 mg/mL的初始濃度，在超凈臺中用0.22μmL的濾膜過濾，然后通過1640培養(yǎng)基依次進行稀釋，配成2，1.6，1.2，0.8，0.4mg/mL的藥物濃度。

2.3.2 抑瘤實驗方法

分別將處于對數(shù)生長期的乳腺癌CMF-7、肺腺癌A549、喉癌Hep-2細胞消化后稀釋成1×106個/mL的腫瘤細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔接種100μL，放置于5 % CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h之后將培養(yǎng)基棄掉，在空白對照組中加入100μL不含血清的1640培養(yǎng)基，在陽性對照組中加入100 μL 濃度為100μg/mL的順鉑，其他給藥組每孔分別加入100μL不同濃度的藥物，每種濃度的藥物分別重復加入5個孔中。之后將細胞放入含5 % CO2溫度為37 ℃的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。等待24 h后，每孔加入20μL 濃度為5 mg/mL的 MTT溶液，將其放回培養(yǎng)箱中避光反應4 h。最后去除上清液，加入100μL DMSO，使用酶標儀在492nm波長處測定OD值，按下式計算出藥物對三種細胞的抑制率。

3 結(jié)果

MTT法測定三種癌細胞的抑制率。五種濃度的全蝎酶解液超濾物對三種癌細胞(Hep-2、A549、MCF-7)抑制率柱狀圖及三種細胞抑制率對比折線圖見圖1、圖2、圖3、圖4。

圖1 不同濃度酶解超濾物對喉癌Hep-2的抑制率

由圖1知，在0.4mg/mL的濃度下，藥物對喉癌Hep-2的增殖無抑制作用，從0.8mg/mL濃度開始，藥物對喉癌Hep-2的抑制率均大于60%，對細胞的生長有明顯的抑制作用。

圖2 不同濃度酶解超濾物對肺腺癌A549的抑制率

由圖2知，在低濃度0.4mg/mL以及0.8mg/mL下，藥物對肺腺癌A549的增殖無抑制作用，從1.2mg/mL濃度開始，藥物對肺腺癌A549的抑制率均大于50%且成良好的線性關(guān)系，對細胞的生長具有明顯的抑制作用。

圖3 不同濃度酶解超濾物對乳腺癌MCF-7的抑制率

由圖3知，在0.4mg/mL濃度下，藥物對乳腺癌MCF-7的增殖無抑制作用，從0.8mg/mL開始，藥物對乳腺癌MCF-7的抑制率均大于80%，在1.2mg/mL濃度時達到最高值99%，從1.6mg/mL濃度開始，藥物對乳腺癌MCF-7的抑制率出現(xiàn)下降趨勢，但從實驗數(shù)據(jù)分析，藥物對乳腺癌MCF-7的生長有明顯的抑制作用。

圖4 三種細胞抑制率對比

由圖4知，在0.4mg/mL濃度下，藥物對三種細胞的增殖均無抑制作用，從1.2mg/mL濃度開始，藥物對三種細胞生長的抑制率均大于50%，藥物對三種癌細胞均有明顯的抑制作用，藥物對喉癌Hep-2的抑制作用強于對肺腺癌A549的抑制作用。

綜上，藥物在濃度較低時對癌細胞增殖無抑制作用，藥物濃度較高時對三種癌細胞增殖均有較好的抑制作用。在此實驗濃度梯度內(nèi)，藥物對喉癌Hep-2、肺腺癌A549細胞增值的抑制作用隨藥物濃度升高而增強，藥物對乳腺癌MCF-7細胞增值的抑制作用隨藥物濃度的增高呈現(xiàn)先增強后下降的趨勢，喉癌Hep-2、肺腺癌A549細胞實驗IC50分別為0.69mg/mL和1.162mg/mL，因此藥物對喉癌Hep-2的抑制作用比對肺腺癌A549的抑制作用強。

4 討論

全蝎具有抗腫瘤、抗凝、抑菌等作用，藥用價值高，歷史悠久，提取方法從最初的水提到現(xiàn)在的酶解、發(fā)酵，不同提取方法所發(fā)揮的藥理作用有所差距，人們不斷去深化其對某一病癥的探索，進而希望能夠靶向治療。

FangwenJiao[4]等人通過正交實驗得到較優(yōu)化的全蝎酶解方法，因此本實驗采用其探究的最優(yōu)酶解工藝進行酶解。由王燕平[6]等人研究可知全蝎含有蛋白質(zhì)、多糖、甜菜堿等多種復雜成分，本實驗在低濃度藥物下細胞增長抑制率出現(xiàn)負數(shù)，可能與全蝎復雜的成分有關(guān)。通過酶解可在溫和的條件下，提高蛋白的收率[7]，由張盼盼[1]等人研究可知全蝎酶解液醇沉后蛋白含量較高，且對肺腺癌A549的生長有抑制作用，本實驗證明全蝎復合酶酶解液>10KDa分子量段超濾物對肺腺癌A549、喉癌Hep-2、乳腺癌MCF-7均有明顯抑制作用，與其結(jié)果基本一致。又由焦方文[8]等人研究全蝎酶解物種多糖含量為13.84%，多糖作為一種增強機體免疫力、降血、抗腫瘤等的生物活性成分，在提取過程中，通過酶解的方法可以大大提高多糖浸出率，可進一步研究全蝎酶解物中多糖的作用。本實驗數(shù)據(jù)表明藥物對喉癌Hep-2的抑制作用比對肺腺癌A549的抑制作用強，為全蝎酶解液超濾物抗腫瘤作用的進一步深入研究提供新思路。