郭 蓉，劉珍洪，汪文來，高 蔚，陶旭光，佟海英，安致君，殷 茵，韓雪珍，Michael XiZhu，楊 楨△，趙紅霞△

(1. 北京中醫(yī)藥大學，北京 100029； 2. 中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎理論研究所，北京 100700；3. 美國德克薩斯大學健康科學中心綜合生物學及藥理學系，休斯頓)

艾葉具有濃厚的芳香氣味，其性味是辛、苦、溫，具有溫經(jīng)止血、散寒止痛、止漏安胎的作用，治療月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、胎動不安、腹中冷痛以及吐血、衄血等病癥。艾葉是溫經(jīng)、散寒止痛的要藥之一，也是中醫(yī)婦科常用藥物之一。

艾葉首記載于梁·陶弘景《名醫(yī)別錄》中將其作用描述為“溫經(jīng)止血、散寒止痛”[1]?！吨兴帉W》將其歸納在止血劑這一章節(jié)，描述其性味為“性溫，味辛、苦”。許多具有辛溫性味的中藥諸如生姜、干姜和辣椒等[2]可以活化熱敏通道TRPV1，艾葉辛溫之性也符合TRPV1激動劑的特征。現(xiàn)代中醫(yī)臨床多將艾葉用于婦科疾病的治療，有較好的溫經(jīng)散寒、止痛作用。此外現(xiàn)代藥理學研究證明，艾葉在抗炎、止痛方面發(fā)揮著顯著作用[3]。但到目前為止，從分子層面研究艾葉溫經(jīng)散寒、止痛作用的分子機制還很少，推測艾葉發(fā)揮其溫經(jīng)散寒、止痛的功效可能是通過熱敏通道TRPV1起作用的。為探討生艾葉對TRPV1 的效應，本實驗采用全細胞膜片鉗技術測試生艾葉醇提物對細胞跨膜電流的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器

1.1.1 藥品 生艾葉于2016年3月份購自北京同仁堂(東四藥店)。

1.1.2 試劑 TRPV1 plasmid(Origene，RC217653)，質(zhì)粒GFP(北京愛思益普)、DMEM cell culture medium、Fetal Bovine Serum、penicillin/streptomycin(Gibco)、Lipofectamine2000(invitrogen)、Capsaicin、DMSO、Sodium chloride、Potassium chloride、Cesium chloride、EGTA、HEPES、Magnesium chloride hexahydrate、D-glucose、Calciumchloride(Sigma)。

1.1.3 儀器 SHZIII型循環(huán)水真空泵(上海亞榮)、數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-6(常州潤華)、PatchMaster數(shù)據(jù)獲取軟件(Heka)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52(上海虹昕)、P-97拉制儀器(Sutter Instruments)、IGOR-Pro分析軟件(WaveMetrics Inc)、EPC-10 Quattro膜片鉗放大器(Heka)、高速萬能粉碎機BDW1-FW100(北京中西遠大科技有限公司)等。

1.2 實驗步驟

1.2.1 生艾葉75%乙醇提取物制備 稱取生艾葉80 g，用粉碎機將其粉碎放入燒杯中，加入75%乙醇800 ml在室溫下浸泡30 min；后將其放在調(diào)至95 ℃的恒溫水浴鍋上，用回流提取器提取2 h，在室溫下將其冷卻；用濾紙慢慢將液體過濾，剩余藥渣再加500ml75%乙醇于回流提取器提取1 h，過濾后與上一次的濾液混合；2次得到的濾液放在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上回收乙醇，所得的膏狀物(不含乙醇)用蒸餾水調(diào)濃度至1 g/ml，-20 ℃冰箱分裝保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和全細胞膜片鉗實驗 HEK293細胞用10%胎牛血清的培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細胞生長情況進行換液和傳代，等待細胞生長至融合度70%左右進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實驗。采用無雙抗的完全培養(yǎng)基對轉(zhuǎn)染上質(zhì)粒的細胞進行培養(yǎng)，24～72 h內(nèi)用于電生理實驗。

1.2.3 全細胞膜片鉗實驗 電極內(nèi)液包括HEPES 10 mmol /L，CsCl 140 mmol/L，EGTA 10 mmol/L，MgCl22 mmol/L，ATP-Mg 1 mmol/L，CaCl25 mmol/L，用CsOH調(diào)pH 值7.2～7.3，自由Ca2+濃度維持在85 nmol/L，細胞外液為glucose 5 mmol/L，CaCl22 mmol/L，NaCl 140 mmol/L，KCl 5 mmol/L，HEPES 10 mmol /L，MgCl22 mmol/L，用 NaOH調(diào)至pH7.4。玻璃電極用拉制儀拉制而成并進行拋光，灌充電極內(nèi)液放在電極夾持器上備用。在顯微鏡下選取細胞完整、橫紋清晰的細胞用于實驗，電極尖端接近細胞表面，接觸到細胞表面時負壓吸取形成高阻封接達到1 GΩ以上，封接完成后進行電極電容補償，觀察1～3 min形成全細胞記錄模式[4]。膜片鉗放大器放大并通過A/D、D/A界面控制刺激的發(fā)放和電壓、電流信號的采集，并存儲在計算機系統(tǒng)中。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果與分析

2.1 生艾葉醇提物對轉(zhuǎn)染TRPV1的HEK293細胞的影響

圖1顯示,TRPV1細胞外液將生艾葉醇提物稀釋成3 mg(生藥)/ml，觀察其對表達TRPV1的HEK293細胞誘導跨膜電流。30 μmol/L辣椒素(capsaicin，Caps)產(chǎn)生的電流影響作為陽性對照，細胞外液對誘導產(chǎn)生的電流作為陰性對照。首先將細胞外液加入并觀察電流的基線水平，待電流穩(wěn)定后加入生艾葉醇提物觀察電流變化，后用細胞外液進行洗脫，使電流恢復至基線狀態(tài)，最后滴加30 μM辣椒素測試其對 HEK293細胞誘導產(chǎn)生的跨膜電流。實驗結(jié)果顯示，與細胞外液比較，生艾葉醇提物能夠?qū)D(zhuǎn)染TRPV1的HEK293細胞產(chǎn)生明顯的跨膜電流(P<0.05)。

注： 左圖：各測試組電流峰值對比統(tǒng)計圖(+100 mV電壓)。右圖：跨膜電流時程圖(+100 mV電壓下)，用電壓斜坡(voltage ramp)檢測到I-V關系曲線，其中a、b、c分別代表細胞外液、生艾葉醇提物、辣椒素。*P<0.05，表示組間差異明顯圖1 轉(zhuǎn)染TRPV1的HEK293細胞上生艾葉醇提物、辣椒素產(chǎn)生的電流效應

2.2 生艾葉醇提物對轉(zhuǎn)染TRPV1的HEK293細胞的量效關系

圖2顯示，在對轉(zhuǎn)染HEK293細胞的TRPV1跨膜電流影響的生艾葉醇提物量效關系研究中，將生艾葉醇提物與細胞外液稀釋成3 mg/ml和10 mg/ml。結(jié)果顯示，與正常細胞外液比較，生艾葉醇提物3 mg/ml、10 mg/ml這2個濃度均可以使細胞產(chǎn)生跨膜電流(P<0.01)，且10 mg/ml產(chǎn)生的跨膜電流大于3 mg/ml，甚至高于10 μmol/L辣椒素產(chǎn)生的跨膜電流。

注： 左圖：各組與10 μM辣椒素活性百分比統(tǒng)計圖(+100 mV電壓)。右圖：跨膜電流時程圖(+100 mV電壓)。** P<0.01圖2 生艾葉醇提物對轉(zhuǎn)染TRPV1的HEK293細胞產(chǎn)生的電流量效研究

3 討論

本研究采用全細胞膜片鉗技術旨在從細胞分子層面了解艾葉發(fā)揮散寒止痛可能作用的分子靶點，首次證明艾葉的醇提物能夠激活熱敏通道TRPV1產(chǎn)生跨膜電流，生艾葉中包含明確的活化TRPV1成分，這從細胞、分子層面對其發(fā)揮溫經(jīng)散寒、止痛功效作了相應的解釋。

艾葉是溫經(jīng)止血藥，用于少腹冷痛、經(jīng)寒不調(diào)、宮冷不孕等。動物行為學實驗顯示，在原發(fā)性痛經(jīng)小鼠模型中，艾葉有明顯的止痛作用[1]。揮發(fā)油在鎮(zhèn)痛作用方面功效顯著，主要與降低血中前列腺素E2含量、調(diào)節(jié)體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、NO水平有關[2]。黃酮類成分現(xiàn)代研究則顯示，在抗炎、鎮(zhèn)痛方面也有一定的作用[3]，但這些作用的分子機制是未知的。

TRPV1是熱敏通道家族的一員，它是熱通道，能夠被溫度(≥43 ℃)、辣椒素和酸度[4]以及炎癥因子所激活，介導著炎癥、疼痛等病理過程[5]。一些芳香類中藥活性成分是熱敏通道激動劑，如辣椒素、生姜、大蒜、胡椒、花椒、樟腦、龍腦、薄荷醇、丁香酚等[5]。

既有的研究表明，艾葉所含主要TRPV1激動劑單獨使用都不能取得比辣椒素更高的活化電流，但本實驗在10 mg/ml的濃度下取得了比10Μm辣椒素更高的活化電流，該電流可能是一種疊加電流。既往研究推測一個方劑如川芎茶調(diào)散，多種中藥包含不同的熱敏通道激動劑，聯(lián)合使用可以加強活化電流，從而增強療效。本研究可能涉及另外一個機制就是1種中藥含有多個熱敏通道激動劑或抑制劑，干預1個或多個相關通道增強了療效。如同艾葉這樣的含有多個強熱敏通道激動劑的中藥是不多見的。因為中藥使用艾葉入藥非單一成分，因此研究粗提物的藥理效應有重要意義。

艾葉的化學成分主要有揮發(fā)油，其次還有黃酮類、三萜類、桉葉烷類、鞣質(zhì)類、多糖類及微量元素等，其中揮發(fā)油、黃酮類成分是艾葉的主要成分，亦是其有效成分[6]。艾葉揮發(fā)油一直被視為評價其藥材質(zhì)量的標準，隨著現(xiàn)代化學分離技術的提高，艾葉揮發(fā)性成分已經(jīng)由最初的十幾種到現(xiàn)在檢測出來的100多種,主要有1,8-桉葉素、龍腦、樟腦、丁香酚、薄荷醇、芳樟醇、α-蒎烯和β-蒎烯等[7-10]。在以單體進行的測試中發(fā)現(xiàn)，1,8-桉葉素可以活化熱敏通道TRPV1、TRPA1和TRPM8[11]，樟腦[12]、丁香酚是TRPV1、TRPA1和TRPV3的激動劑，以及活化熱敏通道TRPV3的如龍腦，活化熱敏通道TRPM8的如薄荷醇和芳樟醇[13]。

熱敏通道TRPV1、TRPA1負責傷害性感受刺激的傳入，這些沖動由三叉神經(jīng)節(jié)和背根神經(jīng)節(jié)傳至大腦，能夠產(chǎn)生寒、熱、痛等感覺[1]。許多辛味中藥諸如辣椒、吳茱萸、干姜、生姜都對熱敏通道TRPV1有激動效應，熱敏通道的激動劑往往能使該通道致敏或脫敏，同時熱敏通道之間還具有交叉脫敏特性。辛味中藥TRPV1激動劑激活熱通道，也能通過交叉脫敏寒通道TRPA1達到散寒目的。另一方面，熱敏通道的功能障礙也能產(chǎn)生痛覺過敏，急性疼痛以TRPV1活化為主，慢性疼痛與TRPA1活化有關。這些熱敏通道都不同程度地參與炎癥性疼痛[14-15]。以宮寒為例，子宮上分布著大量的熱敏通道[16]，婦科的慢性炎癥可以活化TRPA1或TRPM8形成宮寒，而TRPV1的激動劑可以對抗這種作用[17]。

本實驗的結(jié)果可以部分解釋艾葉及其多樣化的制劑發(fā)揮溫經(jīng)散寒、止痛作用的分子機制。在艾葉的復雜成分中,還有黃酮類成分含有芹菜素、山奈酚、木犀草素、槲皮素等，以及三萜類和桉葉烷類成分，其藥效可能還涉及其他機制。目前許多單體的測試工作尚未開展，今后有必要進行更深入的后續(xù)實驗研究。