唐浩斌, 鄧太海, 谷婷婷， 陳舒華△

1廣東醫(yī)科大學研究生學院(廣東湛江 524000); 2贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(江西贛州 341000); 3佛山市第二人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(廣東佛山 528000)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是源于鼻咽部的惡性腫瘤，是我國廣東地區(qū)的高發(fā)癌癥[1]，男性年齡標準化發(fā)病率(ASR)為30/10萬，女性ASR為13/10萬，遠超世界其他地區(qū)(ASR<1/10萬)[2]，具有明顯的地域性，早有學者提出地域性的基礎(chǔ)源于家族的遺傳性，可追溯至先秦時期的百越先民[3]。而近數(shù)十年的研究也不斷證實了家族史與EB病毒一樣，與鼻咽癌具有強相關(guān)性[4-7]。在鼻咽癌高發(fā)區(qū)，鼻咽癌患者的一級親屬是高危人群[8-9]。因此，鼻咽癌高癌家系患者的早期診斷以及對高癌家系患者的一級親屬的早期篩查顯得尤為重要。本研究組曾對鼻咽癌高癌家系患者的外周血及病理組織進行MALDI-TOF-MS初篩，發(fā)現(xiàn)膜連蛋白A7(Annexin A7)出現(xiàn)異常表達[10]。Annexin A7是鈣離子依賴磷脂結(jié)合蛋白多基因家族的一員，與細胞膜運輸、細胞信號轉(zhuǎn)導、細胞分化和增殖、轉(zhuǎn)移有關(guān)[11]，在前列腺癌、消化道腫瘤、乳腺癌中均有明顯的異常表達[12]。但Annexin A7和高癌家系鼻咽癌患者存在何種關(guān)系，此前鮮有報道。因此檢測Annexin A7在鼻咽癌高癌家系癌患者中的表達情況，初步揭示兩者之間的關(guān)系，并且對以后我們尋找高度特異性的鼻咽癌腫瘤分子標記物提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料 所有的鼻咽組織標本均取自佛山市第二人民醫(yī)院耳鼻喉科2009年7—10月門診患者，其中高癌家系鼻咽癌組織15例、散發(fā)性鼻咽癌組織15例、鼻咽黏膜慢性炎癥患者鼻咽組織15例。這些患者均有完整的臨床及病理資料，在30例鼻咽癌標本中，男17例，女13例，根據(jù)鼻咽癌2008分期[13]進行TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期12例，Ⅲ～Ⅳ期18例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例。年齡在20～78歲之間。取出鼻咽組織迅速放入凍存管中，液氮速凍后，置-80℃超低溫冰箱保存。

1.2 檢測材料 RT-PCR試劑盒、Trizol試劑盒、辣根過氧化物酶山羊抗小鼠IgG二抗等購于北京鼎國生物技術(shù)公司。小鼠抗人Annexin A7抗體、β-actin抗體購于美國Sant Cruz公司。

1.3 RT-PCR檢測Annexin A7與α-enolase mRNA的表達 按照Trizol試劑盒說明對標本進行總RNA的抽提。提取后進行取部分進行電泳，在紫外透射儀上觀察，確認提取RNA的完整性及質(zhì)量。同時使用紫外分光光度計上測定A260/A280比值，確保DNA沒有污染。確保提取RNA可用后運用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應體系：隨機引物1 μL，dNTPs 1 μL，5×RT buffer 4 μL，酶混合液1 μL，目的RNA 3 μL，DEPC-ddH2O 10 μL，總體積為20 μL。反應條件：42℃ 60 min，95℃ 5 min，4℃ 1～5 min。取cDNA進行進行PCR定量擴增，反應體系：cDNA 3 μL，10×PCR buffer 5 μL，dNTPs 1 μL，上、下游引物各1 μL，Taq 酶1 μL，ddH2O 38 μL，總體積50 μL。反應條件：95℃預變性5 min，94℃變性30 s，引物57℃退火30 s，72℃延伸40 s，一共完成35個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。以β-actin為內(nèi)參照，計算目的基因的相對基因量。

引物由上海生工生物工程技術(shù)公司設(shè)計合成。具體如下：Annexin A7基因引物序列：上游引物5′-GGGAAATCGTGATGAGAACCAG-3′,下游引物5′-GCCCACAATAGCCAGAAGAAG-3′,擴增片段長度321 bp；β-actin基因引物序列：上游引物 5′-CACCAAATGGGACGACAT-3′,下游引物5′-ACAGCCTGGATAGCAACG-3′，擴增長度189 bp。

1.4 Western blot檢測Annexin A7蛋白的表達 將標本組織裂解提取蛋白質(zhì)，通過BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。取100 μg蛋白樣品行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，通過一抗[鼠抗人AnnexinA7單克隆抗體及β-actin抗體(內(nèi)參照)]和二抗(辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG)反應，最后經(jīng)過DAB顯色劑顯色。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR結(jié)果 在高癌家系鼻咽癌組、散發(fā)性鼻咽癌組及鼻咽黏膜慢性炎癥組中Annexin A7 mRNA的表達量依次為0.828±0.046、0.459±0.048、0.312±0.072,3組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，并且組間兩兩比較結(jié)果差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Annexin A7 mRNA在高癌家系鼻咽癌組織及散發(fā)鼻咽癌組織中表達均有上調(diào)，其中高癌家系顯著上調(diào)(圖1)。

*P<0.05

2.2 Western blot蛋白免疫印跡結(jié)果 在高癌家系鼻咽癌組、散發(fā)性鼻咽癌組及鼻咽黏膜慢性炎癥組鼻咽組織中Annexin A7相對密度值依次為0.867±0.068、0.624±0.065、0.392±0.087，3組間比較結(jié)果差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，并且組間兩兩比較結(jié)果差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，在高癌家系鼻咽癌組織中表達顯著上調(diào)(圖2)。而且Annexin A7蛋白在鼻咽癌組織中的表達與TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與患者的年齡﹑性別無關(guān)。Annexin A7蛋白在Ⅲ～Ⅳ期的表達明顯高于Ⅰ～Ⅱ期，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織中表達高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

*P<0.05

臨床因素例數(shù)Annexin A7蛋白表達t值P值分期2.3730.025 Ⅰ～Ⅱ期120.676±0.036 Ⅲ～Ⅳ期180.792±0.031淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移3.0510.005 有160.810±0.032 無140.672±0.032性別0.7940.434 男170.764±0.035 女130.722±0.037年齡0.3880.701 ≤40歲160.736±0.033 >40歲140.756±0.041

3 討論

Annexin A7最早被發(fā)現(xiàn)于1978年[14]，其基因定位于人類染色體10q21.1～21.2，有47 kD和51 kD兩種亞型[15]，受蛋白激酶調(diào)節(jié)鈣離子依賴性GTP酶的控制，通過介導Ca2+/GTP信號通路在細胞外膜發(fā)揮作用[11]。Annexin A7在肝癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色。Srivastava等[12]發(fā)現(xiàn)Annexin A7在人肝癌組織中高表達。Bai等[16]的研究表明Annexin A7協(xié)同Bcl-2影響肝癌的細胞凋亡過程。而Ye等[17]的研究則揭示Annexin A7參與了胃癌細胞的凋亡，同時其蛋白表達水平也與胃癌細胞的分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)[18]。Torosyan等[19]的研究發(fā)現(xiàn)了Annexin A7能夠抑制激素敏感型的前列腺癌細胞的增殖，提示其在前列腺癌中可能發(fā)揮著抑癌基因的作用。早在2004年，Srivastava等[20]就發(fā)現(xiàn)Annexin A7在乳腺癌組織中高表達，而近期Huang等[21]的研究也提示著Annexin A7的表達水平與乳腺癌患者的預后密切相關(guān)。而本研究組前期研究也發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者的外周血中Annexin A7存在高表達。

本次研究，鼻咽癌高癌家系患者及散發(fā)性鼻咽癌患者組織中的Annexin A7在mRNA及蛋白水平上均出現(xiàn)了高表達，與鼻咽慢性炎癥患者組織的低表達水平存在顯著性差異(P<0.05)，這表明Annexin A7在基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)翻譯水平的表達是一致，這提示該蛋白為鼻咽癌的差異性表達蛋白，進一步證實了本課題組前期研究的成果[10]。Annexin A7在鼻咽癌組織中的高表達，與其在乳腺癌組織中的表達相似[20-21]，這提示其可能作為癌基因而影響鼻咽癌的發(fā)生和發(fā)展的。結(jié)合Ji等[22]的研究結(jié)果可以推測Annexin A7在高癌家系鼻咽癌患者中的高表達，可能激活了Ras-Raf-MAPK通路，使癌細胞異常的生長、增殖及分化，從而影響癌細胞的發(fā)生發(fā)展。但是，Annexin A7在不同的腫瘤中發(fā)揮著不同的作用，既有扮演癌基因角色的[12]，也有以抑癌基因出現(xiàn)的[19]，目前其如何在鼻咽癌中產(chǎn)生作用依然沒有確切定論，因此，Annexin A7在高癌家系鼻咽癌中發(fā)揮著怎樣的功能與機制我們還需進一步研究。

另一方面，本研究中，Annexin A7在鼻咽癌高癌家系及散發(fā)性鼻咽癌兩組患者中的表達存在顯著性差異，在基因轉(zhuǎn)錄及蛋白翻譯層面，高癌家系患者的Annexin A7表達均明顯高于散發(fā)性患者。既往研究[4-7]已表明家族史為鼻咽癌的相關(guān)性因素，具有鼻咽癌家族史的正常人更容易出現(xiàn)鼻咽癌，這提示易感人群的鼻咽組織中癌基因處于略高水平的活躍狀態(tài)。因此，結(jié)合本研究組對F-肌動蛋白α亞基[23]、陳舒華等[24]的研究結(jié)果后，我們推測，鼻咽癌高癌家系成員本身的Annexin A7及其他生物標志物已處在略高于正常人的表達水平，導致其發(fā)病后表達水平進一步升高。反推過來，通過這個差異，我們可以在眾多鼻咽癌患者中發(fā)現(xiàn)高癌家系患者，進而可以對高癌家系成員進行早期的篩查，這對高癌家系患者一級親屬的鼻咽癌篩查和干預有著重要的價值。

此外，本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)Annexin A7蛋白在Ⅲ～Ⅳ期的表達明顯高于Ⅰ～Ⅱ期，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織中表達高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，這與楊民正等[25]得出的結(jié)果相符。由此看出，Annexin A7和鼻咽癌的發(fā)展過程密切相關(guān)，它可以在一定程度反映鼻咽癌惡性程度和浸潤轉(zhuǎn)移程度。這提示我們檢測Annexin A7的表達情況可以評估鼻咽癌的嚴重程度和惡性程度。

綜上所述，本研究通過分析鼻咽癌高癌家系患者、散發(fā)性鼻咽癌患者及鼻咽慢性炎癥患者的鼻咽組織中的Annexin A7表達水平，推測Annexin A7參與了鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展的過程，并發(fā)揮了重要作用。有介于此，Annexin A7有望成為鼻咽癌患者早期評估，特別是高癌家系患者及其近親的早期篩查的指標之一。同時，Annexin A7的表達和腫瘤的分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，也可作為評估腫瘤疾病的嚴重程度和惡性程度的指標，從而指導腫瘤疾病的治療。