劉秭攸，駱嘉言*，蔣澤平

(1.南京林業(yè)大學 材料科學與工程學院，江蘇 南京 210037；2.江蘇省林業(yè)科學研究院，江蘇 南京 211153)

大葉櫸(ZelkovaschneiderianaHand. -Mazz.)又稱血櫸、櫸木、椐木、南榆或櫸榆，主要分布在江蘇、浙江、安徽、湖南、廣西及云南等省區(qū)[1].大葉櫸是一種傳統(tǒng)的家具用材，具有材質堅硬、紋理美觀、顏色鮮亮、抗壓耐腐等優(yōu)點，與櫸屬其他幾個種的木材相比，大葉櫸品質最好，應用也最為廣泛[2].在櫸木家具的研究中，常常會將大葉櫸與榔榆、歐洲山毛櫸等木材混為一談，櫸屬幾個種之間的區(qū)分也不明顯，而且明清至民國時期的櫸木家具用材與現如今裝修所用的櫸木是否相同，也存在許多爭議[3].

傳統(tǒng)的木材鑒別主要利用形態(tài)學和解剖學手段，通過實踐經驗和顯微技術結合進行鑒定，而近源物種往往結構相似，難以區(qū)分，給準確鑒定帶來了困難[4].近年來，木材的DNA分子檢測逐漸發(fā)展，成為一種新的鑒定手段，但是目前關于木材分子水平的鑒定案例并不多見，主要是因為木材中的DNA難以提取，尤其在經過加工處理后更難提取.如何有效地從木材中提取足量并可用于PCR擴增的DNA成為當務之急.此外，對于不同的樹種、不同的保存時間、不同取樣部位的木材，適用的DNA提取方法也不盡相同[5].王英等[6]利用CTAB法、CTAB-SDS法和試劑盒法對3種楠木進行了DNA提取，并進行了PCR擴增；Asif 等[7]利用CTAB法、Qiagen試劑盒和PTB法分別對氣干的拉敏白木(Gonystylusbancanus)和未知材種的已加工木材進行DNA提取，發(fā)現只有PTB法可以提取出合格的DNA；余敏等[8]對比了3種DNA提取方法，發(fā)現改良的CTAB法對于氣干黃檀屬木材邊材有較好的DNA提取效果，但心材DNA只有PTB法可以提出；Watanabe等[9]使用Qiagen試劑盒提出了不同樹齡、不同采伐年限的日本柳杉(Cryptomeriajaponica)的殘余DNA，并用于qPCR擴增；劉金良等[10]針對進口的6類針葉木木材，選出了適合的CTAB-SDS-磁珠相結合的DNA提取和純化體系.木材本身DNA的降解程度和DNA提取的方法，決定了提取的木材的DNA的數量和質量.

目前對大葉櫸DNA提取方法的研究，樣品主要是葉片，對木材的DNA提取研究較少.而要從分子層面對大葉櫸木制品進行鑒定鑒別，所得樣品往往是已經采伐加工過的氣干木材，采伐后的使用或存儲年限有長有短，適用于葉片的DNA提取方法用于木材無法取得良好的提取效果.因此，針對大葉櫸采伐后不同時間保存的氣干材，進行DNA的提取和ISSR引物的PCR擴增，筆者采用了6種DNA提取方法，對比選出最適合大葉櫸木材DNA提取的方法，對木材DNA的提取方法以及從分子層面進行木材鑒定提供一定參考.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用材料為大葉櫸小枝材和標本心材，新鮮葉片(僅用于引物篩選)詳見表1.所有木材樣品采集后不做任何處理，立即放入-80 ℃冰箱保存.直到提取DNA時再進行消毒除菌，具體為去除樹皮，切除木材表層并用冷凍的70%乙醇浸泡2 min，而后迅速用無菌水沖洗，無菌紙擦干，木材組織切片機切成40 ～ 70 μm厚的碎片，最后放入液氮預冷的密封容器中備用.

表1 實驗用材信息

實驗所用試劑如下：2%十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)緩沖液(Solarbio，純度>99.0%)，20%十二烷基硫酸鈉(SDS)緩沖液(Solarbio)，0.5 M EDTA(Solarbio，pH 8.0)，1 M Tris-HCl(Solarbio，pH 8.0)，7.5 M 醋酸銨(阿拉丁，純度AR)，0.1M 苯甲酰溴(PTB)(電詢，純度>98.0%)，酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)(北京天根生化)，氯仿/異戊醇(24∶1)(北京天根生化)，β-巰基乙醇(Sigma-Aldrich，純度>99.0%)，異丙醇(Kermel，純度AR)，70%乙醇(眾望)，TE緩沖(Solarbio，pH 8.0)，RNase(Solarbio，100 mg·mL-1)，植物基因組DNA提取試劑盒(北京莊盟生物)，新型快速植物基因組DNA提取試劑盒(上海瑞杰生物)，50×TAE電泳緩沖液(Solarbio)，無菌水(蒸餾水高壓高溫滅菌)，蛋白酶K(Solarbio，20 mg·mL-1)，瓊脂粉(Biowest).

1.2 實驗方法

1.2.1 大葉櫸木材DNA的提取

實驗共采用6種DNA提取方法，CTAB法、SDS法、CTAB-SDS法、兩種試劑盒法(試劑盒1：植物基因組DNA提取試劑盒；試劑盒2：新型快速植物基因組DNA提取試劑盒)和PTB法對大葉櫸木材殘余DNA進行提取，詳見表2.其中，PTB法僅對B1和B2樣本進行DNA提取.提取前用液氮將葉片或木材碎片充分研磨成粉末.

表2 6種DNA提取方法的步驟

1.2.2 ISSR引物篩選

從大葉櫸新鮮樹葉中提取DNA，用來進行ISSR引物篩選.從52個ISSR引物中篩選出27個具有條帶的引物，詳見表3及圖1.其中，引物818，828，836主條帶清晰明亮，片段長度大于1 000 bp，穩(wěn)定性好，選用于后續(xù)木材PCR擴增的檢測.

1.2.3 PCR擴增

分別以各樣品提取的基因組DNA為模板，用上述ISSR 引物中的828和836號引物進行PCR擴增，反應體系(20 μL)：DNA模板(稀釋至約50 ng·μL-1)，1 μL；ISSR引物(10 mmol·L-1)，1 μL；10×Taq buffer(含 Mg2+)，2 μL；dNTP mixture(10 mmol·L-1)，2 μL；Taq DNA 聚合酶(2.5U·μL-1)，0.4 μL；無菌水，14 μL.反應程序：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸80 s，循環(huán)30次，72 ℃終延伸7 min. PCR產物用5×loading buffer染色后進行凝膠電泳.

表3 27條ISSR引物及其擴增結果

注：R=(A , G) ,Y=(C , T) ,B=(C , G, T) ,H=(A , C , T), V=(A , C , G).

圖1 27條引物ISSR-PCR 擴增電泳圖

1.2.4 DNA濃度和純度檢測

用NanoDrop3000光度計測定DNA質量和數量，測定DNA的OD260/280值和濃度.同時使用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的量和降解程度，凝膠中瓊脂糖濃度1.2%，上樣量6 μL，使用marker DL2502與樣品對比，電泳緩沖液為 1×TAE，電壓200 V，電泳25 min.電泳結束后放入GenoSens凝膠成像系統(tǒng)中觀察拍照.

2 結果與分析

2.1 不同方法提取的木材DNA的濃度和純度

對于提取的基因組DNA，當OD260/280值在1.7 ～ 1.9之間時，DNA質量好、純度高，RNA、蛋白質、多糖及酚類等雜質含量少，能夠進行PCR擴增.雜質的存在會影響紫外分光光度計測量DNA濃度的準確度，當測得的OD260/280值不在1.7 ～ 1.9范圍時，DNA濃度值往往不準確[11].此外，雜質中的PCR抑制物會影響PCR的正常擴增，如果無法進行PCR擴增，則說明DNA提取失敗.基因組DNA中雜質的來源，除了木材本身含有的，還有提取過程中由于溫度變化發(fā)生的副反應，使得還原性糖和蛋白質之間交聯(lián)，阻止了DNA的釋放，產生了更多PCR抑制物[12].

6種不同DNA提取方法提取不同氣干時間木材樣本的DNA，所提DNA的濃度和質量列于表6.

表4 6 種 DNA 提取方法提取不同氣干時間木材的 DNA 的濃度和質量

注：加粗項可進行PCR擴增，*標項為2.2使用樣品.

通過實驗數據可以看出，不論哪種提取方法，隨著氣干時間的延長，可提取的DNA的量逐漸減少.CTAB法和CTAB-SDS法在提取木材樣本時，提出的DNA數量充足，濃度相對其他方法高；對于S、Q1和Q2，提取的DNA純度很好，能夠進行PCR擴增，但是B1和B2 OD260/280值低，只有CTAB-SDS法提取出的4年樣本可以進行PCR擴增.SDS法提取各樣的濃度雖然高，但OD260/280值在1.60以下，不能進行PCR擴增.SDS能夠解聚細胞中的核蛋白，與蛋白質形成復合物，從而造成蛋白質沉淀，但是對于多糖和酚類物質的去除效果不佳[13].酚類物質經氧化后易與DNA共價結合引起褐變，使DNA失活.CTAB-SDS法在提取過程中，上清液表層漂浮一層白色蛋白質層，而CTAB法與SDS法相比則沒有，可能是SDS與小分子蛋白質的結合物，比重輕于CTAB上清液從而無法沉淀，吸取上清液時要避開該層；SDS法提取過程中，這類蛋白質懸浮于上清液中難以離心分離，造成一定蛋白質殘留.PTB法被用于考古生物材料的DNA提取，對于DNA分子比一般DNA提取方法更敏感，能顯著提高DNA提取的數量[14].PTB法在提取DNA時，由于提取時間跨度大，產生許多雜質，必須經過額外的純化處理，處理后純度得到提高，但分子較小的DNA同時也被洗脫，濃度低，只有PTB法成功提取出了長期氣干樣品的DNA.試劑盒提取時，受試劑盒條件限制，使用的木粉原料少，兩種試劑盒法提出的DNA數量遠少于后三者.試劑盒2法提取的各種DNA濃度遠高于試劑盒1法，試劑盒1法所提的DNA濃度低，OD260/280值低，不適合進行大葉櫸木材DNA的提取.試劑盒法2提出的DNA數量充足，S與Q1的OD260/280值大于2.0，有RNA雜質殘余，但是并不影響PCR擴增，試劑盒2法可用于1 a內的氣干大葉櫸木材的DNA提取.

當提取的基因組DNA數量多、質量好時，基因組DNA電泳圖條帶明亮清晰，豐度高、數量充足時甚至有出帶現象；拖尾現象則表明DNA存在彌散降解[15].圖2為6種方法提取木材DNA基因組的電泳圖.

圖2 6種方法提取木材DNA基因組DNA電泳圖

由圖2可以看出，隨著氣干時間的延長，木材中所能提取出的DNA的量逐步減少，條帶變暗，豐度降低.6種方法提取的DNA均存在不同程度的降解，片段范圍從100 bp至5 000 bp以上.出現明顯條帶的基因組DNA才能進行PCR擴增，僅僅只有彌散分布的DNA或沒有任何熒光反應的，則無法擴增.對于1 a內大葉櫸氣干材，CTAB法和CTAB-SDS法的基因組DNA電泳圖豐度最高，存在少量DNA彌散分布；對于2～4 a和長期氣干的木材，所有方法提出的DNA豐度都低，熒光反應微弱或無，且大多呈彌散分布.

2.2 不同氣干時間木材DNA的PCR擴增

從6種方法提取出的大葉櫸木材DNA中，選出每種氣干時間質量最優(yōu)的DNA，無菌水稀釋后進行ISSR-PCR擴增，引物為818，828，836，擴增結束后進行凝膠電泳分析，結果如圖3所示.ISSR引物屬于非特異性引物，具有很好的隨機性，可以同時擴增多個位點，形成多種不同長度的擴增產物[16].

圖3 不同氣干材ISSR-PCR擴增比較

由圖3可知，木材DNA片段隨時間變化會有不同程度的降解，出現DNA總量減少，DNA大分子鏈斷裂，小分子片段增多的現象.在ISSR-PCR擴增過程中，除了模板DNA的長度，Taq酶和延伸時間也會影響擴增產物片段的長度[17]，實驗所用酶的合成效率為1～2 kb·min-1.引物818擴增出的片段分布在300 ～ 1 300 bp之間，引物828在250 ～ 2 000 bp之間，引物836在250 ～ 1 500 bp之間.S、Q1和Q2擴增出的條帶明亮，與葉片擴增產物相比沒有缺失；B1相對暗淡，可能是因為DNA模板的濃度低、質量差、含有相對更高含量的PCR抑制物造成的.B2條帶最暗，由于PTB法純化過程中洗去了許多分子片段，818只在750 ～ 1 500 bp擴增出了3條條帶，其余條帶未見；828呈彌散分布，未擴增出條帶；836在500 ～ 1 500 bp及1 500 bp以上擴增出了4條條帶，說明引物836對B2的DNA模板最敏感，其重復序列和錨定堿基在B2的DNA模板上隨機性最高.

3 討論與結論

木材的形成是具有分生能力的形成層細胞程序性死亡的過程，細胞核皺縮，DNA被核酸酶分解成片段.木質化完成時，木材中占絕大多數的木纖維和導管分子已經不含遺傳物質，其中含有質粒的細胞器也溶解消失，只在存活時間較長的薄壁組織和木射線中會含有少量的DNA[18].在大葉櫸木材細胞中，薄壁組織含量較低，木射線含量較多，但兩者占所有木材細胞的比例不到一半，DNA含量不高.新鮮的木材中，心邊材的薄壁組織和木射線均具有活性，尤其是邊材還含有較多的細胞核，隨著氣干時間的延長，細胞死亡，DNA進一步降解，此時，木射線較軸向薄壁組織含有更多的殘余的DNA[19].木材中DNA的量少，且隨著氣干時間的延長持續(xù)降解，提取也越加困難.

木材的DNA含量遠遠少于樹木的其他組織，但木材的內含物豐富，尤其是心材，使得影響DNA提取的雜質含量相對其他組織較高.為了能夠有效去除這些雜質，在木材細胞研磨和裂解過程中添加β-巰基乙醇和PVP來抑制酚類氧化，增加氯仿-異戊醇的抽提次數來除去多糖和蛋白質[20].大葉櫸屬于多糖、酚類物質含量較高的樹種，這兩種物質會影響DNA的釋放和純化[21]，木材中多糖相對葉片較少，但酚類物質相對較多.此外，大葉櫸木材采伐后，隨氣干時間的延長，其心材材色會因氧化反應越加偏紅，其中的單寧、色素等物質進一步積累增多，給DNA的提取和PCR擴增進一步帶來了影響.相對于葉片提取，筆者實驗中適當延長了木材細胞的裂解時間，使得殘余的DNA得以充分釋放，盡可能地提高了DNA的產量.為了保證DNA純凈，實驗過程中在每次抽提時，都會加入適量β-巰基乙醇，以防止酚類物質使DNA失活褐變；最終回收上清液中DNA時，使用DNA吸附柱來確保DNA與多糖等雜質的進一步分離，防止離心時未除盡的雜質與DNA一同沉淀，而后再用酒精沖洗.

在分子層面鑒別木材，一般使用DNA分子標記和DNA條形碼兩種手段，側重于評估分子標記或者條形碼在鑒別時的引物通用性、序列質量和物種鑒定能力等[22-23].DNA分子標記簡單、快速、易于自動化，通過指紋圖譜反應物種的特異性，筆者實驗中利用ISSR分子標記進行PCR擴增.ISSR分子標記技術已較為成熟，其穩(wěn)定性好，多態(tài)性高，可以有效揭示林木種群間及種群內的遺傳多樣性，并且對DNA質量要求較低，適用于木材中提取的DNA[24].實驗中發(fā)現，就PCR成功率而言，引物818，828，836適用于大葉櫸木材DNA的提取，其他引物雖然在擴增葉片提取的DNA時，PCR成功率較高，可對于木材DNA則難以擴增成功，這主要受DNA質量、片段長度、錨定堿基在DNA模板的重復率以及酶對引物的敏感程度的影響.實驗中發(fā)現，受到木材DNA降解的影響，一些能從新鮮木材DNA中擴增出的條帶位點，隨著木材氣干時間的延長而無法擴增，條帶相比葉片擴增的指紋圖譜有較多缺失，這給構建穩(wěn)定的指紋圖譜帶來難度.

通過6種DNA提取方法對不同氣干時間的大葉櫸木材DNA進行提取及ISSR-PCR擴增的結果比較，可以得出以下結論：

(1) 對不同氣干時間的大葉櫸木材可以使用不同的DNA提取方法，氣干1 a之內的可使用新型快速植物基因組DNA提取試劑盒，氣干4 a之內的可以使用CTAB-SDS法，而長期氣干的只能使用PTB法；

(2) 6種DNA提取方法中，CTAB-SDS法提取濃度最高，質量最好，其次是CTAB法，普通植物基因組DNA提取試劑盒提取效果最差；

(3) 隨著氣干時間的延長，大葉櫸木材可提出的DNA越來越少，質量也隨之下降，但4 a內可提出的DNA分子片段的長度，至少達到1 500 bp；

(4) ISSR引物818，828，836可擴增出豐度好、片段超過1 000 bp的大葉櫸DNA片段，對于已經降解的大葉櫸木材DNA，引物836最為合適，擴增出的DNA分子片段最長接近1 500 bp.