庫(kù)麗扎達(dá)·木拉提

（新疆維吾爾自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察所，新疆 烏魯木齊 830063）

硫酸黏菌素，又稱(chēng)硫酸黏桿菌素、硫酸抗敵素、克利斯汀、多粘菌素E、抗敵素等，分子式為C52H98N16O13·2H2SO4，分子量為1352。純品為白色或類(lèi)白色粉末，易溶于水。硫酸黏菌素是堿性多肽類(lèi)抗生素，主要用于防治敏感菌的感染和促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)。硫酸黏菌素可以與細(xì)胞膜脂蛋白游離磷酸鹽結(jié)合，使得細(xì)胞膜表面張力減小、通透性增加，導(dǎo)致胞漿外流，細(xì)胞死亡。硫酸黏菌素對(duì)革蘭氏陰性菌有強(qiáng)抑制作用，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和真菌無(wú)作用。硫酸黏菌素發(fā)酵液毒性較低，不易造成藥物殘留，不易產(chǎn)生耐藥性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

高效液相色譜儀：Agi1ent1260（美國(guó)Agi1ent公司）；百萬(wàn)分之一天平（Mett1er xs105）；5 mL一次性注射器。

1.1.2 試劑和試藥

甲醇（色譜純，賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司），乙腈（色譜純，賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司），水（超純水），磷酸（分析純，北京北化精細(xì)化學(xué)品有限公司），無(wú)水硫酸鈉（分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；硫酸黏菌素標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)為 20170314，含量為 E1：29.6%，E2：50.3%，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)，硫酸黏菌素發(fā)酵液（發(fā)酵放罐樣品）：規(guī)格根據(jù)發(fā)酵液發(fā)酵的不同時(shí)段有不同的效價(jià)。

1.1.3 溶液的制備

1.1.3.1 稀磷酸（10%） 吸取7 mL磷酸到100 mL容量瓶，用水定容至刻度。

1.1.3.2 緩沖液 稱(chēng)取4.46 g無(wú)水硫酸鈉，加900 mL水，用10%稀磷酸調(diào)pH至2.4，再用水定容至1 000 mL，過(guò)濾，超聲，待用。

1.1.3.3 混合溶劑 將水、乙腈按4∶1混合，過(guò)濾，超聲，待用。

1.1.4 標(biāo)準(zhǔn)品溶液

將25 mg硫酸粘菌素標(biāo)準(zhǔn)品用混合溶劑溶解并定容至50 mL，搖勻，即得硫酸粘菌素標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0.5 mg/mL）。

1.1.5 樣品處理

取發(fā)酵放罐樣品濾液2.5 mL，置50 mL容量品中，用超純水稀釋至刻度，使用混勻機(jī)充分混勻，并使用微孔濾膜過(guò)濾。

1.2 方法

高效液相色譜法。

1.2.1 色譜條件

色譜柱為C18，4.6 mm×150 mm，3 μm，流動(dòng)相為用250 mL容量瓶量取乙腈至刻度，依次用20 mL及10 mL移液管共移出乙腈30 mL，將剩余220 mL乙腈全部移至1 000 mL容量瓶中，加緩沖液至刻度后，再添加3 mL乙腈，混勻，過(guò)濾，超聲，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm，進(jìn)樣量20 μL。

1.2.2 含量測(cè)定

首先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)品溶液兩針，記錄相關(guān)峰面積，再進(jìn)樣品溶液兩針，記錄相關(guān)峰面積，計(jì)算硫酸粘菌素發(fā)酵液含量（發(fā)酵120 h以上的效價(jià)，應(yīng)≥12 000 μg/mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 計(jì)算公式

總含量（μg/mL）=E1含量+E2含量 (結(jié)果見(jiàn)圖 1、圖 2）

2.2 高效液相色譜圖（硫酸黏菌素標(biāo)準(zhǔn)品、樣品色譜圖）

圖1 硫酸黏菌素標(biāo)準(zhǔn)品

圖2 硫酸黏菌素發(fā)酵液樣品色譜圖

2.3 精密度試驗(yàn)

取1.1.5項(xiàng)下硫酸黏菌素樣品溶液20 μL，按1.2.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)6次，記錄色譜圖峰面積結(jié)果見(jiàn)表1。硫酸黏菌素峰面積的RSD為0.11%，表明色譜系統(tǒng)精密度良好。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果表

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取按1.1.5項(xiàng)制備的6份供試品，按1.2.1色譜條件分析，記錄色譜圖，計(jì)算含量，平均值為10 660 μg/mL，RSD為0.18%，表明該方法中硫酸黏菌素的重復(fù)性良好，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討 論

用該方法測(cè)定硫酸黏菌素發(fā)酵液含量，同一樣品平行測(cè)定6次平均含量值為18 666.8 μg/mL，峰面積的RSD為0.11%；經(jīng)測(cè)定6個(gè)樣品含量平均值為18 886.7 μg/mL；RSD為0.80%；硫酸黏菌素發(fā)酵液經(jīng)過(guò)精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果RSD均在規(guī)定的范圍內(nèi)，且有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

4 結(jié) 論

用HPLC法測(cè)定硫酸黏菌素發(fā)酵液含量，方法合理、操作便捷，適合于硫酸黏菌素發(fā)酵液的檢測(cè)，并控制該產(chǎn)品的質(zhì)量，可作為硫酸黏菌素發(fā)酵液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，用于硫酸黏菌素的含量測(cè)定，以控制、保證產(chǎn)品質(zhì)量。