米麗開姆·托合提尼亞孜 張雪萍 何川川 童劍軍楊 倩 李有文,2*

（1 塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾843300）

（2 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆 阿拉爾843300）

（3 塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾843300）

羊痘是由羊痘病毒（Capripox virus, CPV）感染山羊、綿羊或牛等反芻動物引起的一種烈性傳染病。病畜以發(fā)熱、全身起痘為典型特征［1］。羊痘病毒包括山羊痘病毒（Goatpoxvirus, GTPV），綿羊痘病毒（Sheeppoxvirus, SPPV）和皮膚疙瘩病病毒（Lumpy skin disease virus,LSDV）三個種［1］。

一般來說，羊痘病毒對宿主的感染范圍是非常局限的，即山羊痘病毒只感染山羊而綿羊痘病毒只感染綿羊，皮膚疙瘩病病毒只感染牛，但實際生產(chǎn)中也有交叉感染［2,3］，人也偶有感染的報道。羊痘病毒是在細胞漿內(nèi)復(fù)制的有囊膜的雙股DNA 病毒［4］。成熟的病毒粒子多呈卵圓形，大小約為150～180 nm×150～180 nm［5］。山羊痘病毒基因組呈線形，全長約150 kb，共編碼147 個開放閱讀框（ORF），編碼密度為93%［6］。其中間區(qū)域（ORFs024～123）是羊痘病毒的保守序列，編碼與病毒DNA 復(fù)制，轉(zhuǎn)錄，蛋白合成、加工等生長繁殖相關(guān)的重要蛋白［2］。核心蛋白就是中間區(qū)域中一類重要的結(jié)構(gòu)蛋白［3］。對山羊痘病毒Pellor 株的全基因組研究發(fā)現(xiàn)其含有3 種6 個病毒核心蛋白［2,7,8］：包括1 個病毒核心蛋白（viral core protein）ORF091 基因，3 個DNA 結(jié)合的病毒核心蛋白（DNA-Binding core protein）ORF027、ORF039、ORF059 基因和2 個推測的核心蛋白（Putative core protein）ORF037、ORF053 基因［5］。核心蛋白是一種多功能蛋白，對丙肝病毒（HCV）研究發(fā)現(xiàn)其核心蛋白是病毒粒子核衣殼的組成成分，HCV 核心蛋白的表達可以引起肝脂肪變性和肝細胞癌（HCC）的發(fā)生［9］。另外，HCV 核心蛋白還可抑制宿主的免疫功能，干預(yù)細胞凋亡及正常生長過程等［10］。對于羊痘病毒核心蛋白的研究資料尚不多，但肯定會有重要作用，為了了解羊痘病毒核心蛋白ORF059 結(jié)構(gòu)特點和生物學(xué)特點，本研究擬對2010年新疆南疆暴發(fā)的山羊痘疫情中的山羊痘病毒分離珠（GTPV-Thx-2010）的ORF059 基因進行擴增、序列分析，并進行原核表達,初步研究其生物學(xué)特性，為進一步對其生物學(xué)功能和作用機制等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株與菌種

本實驗的毒株來自新疆南疆2010 年流行的羊痘分離株（THX 株），保存于塔里木畜牧科技重點實驗室；原核表達系統(tǒng)用宿主大腸桿菌DH5α、BL21、原核表達載體pET-42 b 含His 標簽均保存于新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木畜牧科技重點實驗室。

1.1.2 主要藥品及試劑

2×Utaq PCR Mix（購買自北京莊盟國際生物基因科技有限公司），PrimeSTAR HS DNA Polymerase、dNTP、T4 DNA 連接酶（購自大連寶生物科技有限公司），瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒（購買北京天根生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司），EcoRI、XhoI（購自Thermo 公司），DNA 純化試劑盒（購自美國Omega公司）。Western blot 用DAB 顯色劑（購買自武漢博士德生物工程有限公司），實驗常用試劑配制方法見附錄。

1.1.3 主要使用儀器

瓊脂糖水平電泳儀（北京六一生物科技有限公司），F(xiàn)250 經(jīng)濟型加熱制冷循環(huán)器（優(yōu)萊博技術(shù)（北京）有限公司），ZWY-103B 恒溫培養(yǎng)振蕩器、ZXGPB2160 隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海智城分析儀器制造有限公司），全自動凝膠成像分析儀、HC 高電流電泳儀、T100 Thermal Cycler 梯度PCR 儀、Mini-PROTEAN Tetra 電泳槽、Mini-Trans-Blot 電泳轉(zhuǎn)印槽（Bio-Rad生命科學(xué)有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 山羊痘病毒基因組的提取

將被病毒感染過的細胞培養(yǎng)液取200 μL 到1.5 mL 的離心管中，按照天根生物科技有限公司的病毒基因組提取試劑盒說明提取山羊痘病毒基因組備用。

1.2.2 原核表達載體構(gòu)建

1.2.2.1 引物合成

根據(jù)參考已經(jīng)在GenBank 上發(fā)表的羊痘病毒基因的全序列（GenBank AF124517）中059 號基因的序列，用DNAMAN 軟件設(shè)計059 號基因的特異性引物，為了便于后期克隆，分別在其上下游引物的5′端加NdeΙ、XhoΙ 限制性內(nèi)切酶切位點（下劃線處），引物由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成，見表1。

表1 合成的引物

1.2.2.2 059基因的擴增

以GTPV-THX-2010 株提取的基因組為模板，用059基因的特異性引物PCR 擴增。100μL擴增體系：模板4. 8 μL，5×PrimeStar Buffer 20 μL，dNTP4 μL，上下游引物各2. 4 μL，PrimeStar HS DNA Polymerase 1.2μL，dd H2O 65.2μL。擴增程序：94 ℃40 s、94 ℃30 s、57 ℃40 s、72 ℃40 s，72 ℃10 min，30 個循環(huán)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后純化回收（按照DNA回收試劑盒操作）。

1.2.2.3 059基因與質(zhì)粒的酶切與純化

取059 基因20 μl，pET-42b 質(zhì)粒15 μl 分別于兩個離心管，分別加通用10xBuffer 4 μl，EcoRI 2 μl，XhoI 2μl，加入水至40μl，充分混勻后，于37 ℃水浴鍋中3 h。酶切產(chǎn)物用DNA純化試劑盒純化，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.4 059基因與原核表達載體的連接與鑒定

將酶切純化的059 基因5 μl 與載體1 μl 于同一離心管中，加T4 連接酶1 μl，10xT4buffer 1 μl，水2 μl，于16 ℃水浴連接8～10 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)DH5α 并涂板培養(yǎng)12 h，挑菌搖菌，做菌液PCR 鑒定，PCR 陽性菌提取質(zhì)粒，并做雙酶切（EcoRI/XhoI）鑒定，質(zhì)粒送武漢天一輝遠生物有限公司測序鑒定。

1.2.3 THX 株059基因核苷酸及推測的氨基酸序列分析059 基因的測序結(jié)果利用軟件DNAMAN 和DNASTAR 進行同源性比較和遺傳進化關(guān)系分析。并推測其氨基酸序列，做蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析和分子量預(yù)測。

1.2.4 059蛋白表達及鑒定

1.2.4.1 059蛋白的表達取經(jīng)鑒定構(gòu)建正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)BL21，按張孝忠等［11］的方法表達并鑒定其結(jié)果。

1.2.4.2 Western Blot檢測

對059 基因的表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE 電泳。按張孝忠等［11］的方法表達并鑒定其結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增目的基因

目的基因通過PCR 擴增之后，其產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定得到GTPV-059 號基因全長結(jié)果，765bp處有一條帶，與理論值相符，見圖1。

圖1 GTPV-059基因PCR擴增

2. 2 PET42b-GTPV-059 重組質(zhì)粒的菌液PCR 檢驗結(jié)果

按照分子克隆的常規(guī)方法，將pET42b 載體和PCR產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)化后挑單菌落搖菌并進行菌液PCR 鑒定，得到PET42b-GTPV-059的陽性質(zhì)粒結(jié)果見圖2。

圖2 PET42b-GTPV-059重組質(zhì)粒菌液PCR鑒定

2.3 PET42b-GTPV-059重組質(zhì)粒雙酶切結(jié)果

雙酶切鑒定重組質(zhì)粒PET42b-GTPV-059的鑒定結(jié)果見圖3。

圖3 PET42b-GTPV-059重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

2.4 GTPV-059基因序列分析

表2 GTPV-059基因核苷酸及氨基酸序列

THX 株059 基因的測序結(jié)果如表2 右側(cè)所示，該基因全長約765 bp，與參考株GTPV-Pellor 相似性高達99.34%，序列分析顯示該基因C+G 含量為26.12%，與羊痘病毒整體GC 組成一致；推測編碼255 個氨基酸（如表2 左側(cè)），其中強酸性氨基酸（D,E）35 個，強堿性氨基酸（K,R）32 個，等電點為5.4，分子量為29 KDa，陰影區(qū)為強堿性區(qū)域。

2.5 GTPV-059遺傳進化樹

根據(jù)GTPV-059 的測序結(jié)果，與GenBank 中發(fā)表的羊痘的序列做遺傳進化分析，本次分離的山羊痘病毒南疆株與其他山羊痘病毒株聚于一個分支，親緣關(guān)系最近。對059 基因，羊痘病毒屬的三處種中，綿羊病病毒與疙瘩皮膚病病毒的親緣關(guān)系相對較近，而與山羊痘病毒的關(guān)系較遠（見圖4）。

圖4 GTPV-059基因遺傳進化關(guān)系分析

2.6 GTPV-059蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

對推測的GTPV-059 蛋白的氨基酸序列進行分析，預(yù)測其蛋白二級結(jié)構(gòu)以α 螺旋為主，多個α 螺旋與β 折疊結(jié)構(gòu)交織，并有較多的轉(zhuǎn)角相連，蛋白有較強的親水性和抗原性，見圖5。

圖5 GTPV-059蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

2.7 059蛋白表達檢測

本實驗通過SDS-PAGE 電泳對原核表達中的蛋白進行檢測，發(fā)現(xiàn)GTPV-059 蛋白大小29 KDa，與理論一致，蛋白表達量較高，見圖6。

圖6 059蛋白原核表達檢測

2.8 059蛋白Wastern-blot鑒定

用His 一抗鑒定059 蛋白與His 標簽融合表達的結(jié)果見圖7。

圖7 059蛋白表達的Wastern-blot鑒定

3 討論

核心蛋白是一類與糖胺聚糖共價結(jié)合的多肽鏈的總稱，也是一類具有重要生物功能的蛋白質(zhì)，所有生物均含有核心蛋白，包括動植物和細菌病毒等微生物［12］。目前發(fā)現(xiàn)的核心蛋白約2 萬～25 萬種。羊痘病毒就含有至少6種核心蛋白，這可能與痘病毒特殊而復(fù)雜的增殖過程相一致。痘病毒是一類有囊膜的不分節(jié)段的大型雙股DNA 病毒，與許多dsDNA 病毒在宿主在細胞核中復(fù)制不同的是痘病毒有自己在宿主細胞質(zhì)中復(fù)制的特殊復(fù)制機制，病毒增殖過程中的很多酶、調(diào)節(jié)蛋白都是由病毒自身的蛋白完成，病毒轉(zhuǎn)錄只識別痘病毒科的啟動子，病毒基因表達分兩個階段，早期基因編碼非結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)參與基因組復(fù)制，晚期基因編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白［13］。在此過程中，核心蛋白可能發(fā)揮重要作用。目前研究發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病毒（HBV）核心蛋白（HBc）作為pregenomic啟動子的轉(zhuǎn)錄激活劑［14］。

在本研究中，克隆了新疆南疆2010 年暴發(fā)的羊痘病毒疫情中的分離株THX株的ORF059基因，并構(gòu)建了原核表達載體PET42b-GTPV-059，用IPTG 誘導(dǎo)表達了其蛋白，并分析預(yù)測了其二級結(jié)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)該蛋白是以α-螺旋為主，β-折疊或片層結(jié)為輔，并由少量的轉(zhuǎn)角連接，交替形成的蛋白的二級結(jié)構(gòu)（見圖5）。作為一個核蛋白，其應(yīng)該是一個帶陽離子的堿性蛋白，但是該蛋白等電點為5.4，是一個酸性蛋白。分析該蛋白氨基酸組成發(fā)現(xiàn)其中間區(qū)域有一個強堿性區(qū)域（見表2-AA 序列中陰影），對應(yīng)區(qū)域也是強的親水性區(qū)域（見圖5 第8 行122-127 區(qū)域），這可能是一個與核苷酸結(jié)合的位點。另外DNA 結(jié)合蛋白質(zhì)可能包含鋅指，helix-turn-helix，亮氨酸拉鏈等結(jié)構(gòu)，促進核酸綁定。圖5 所示有二級結(jié)構(gòu)中可見有多個helix-turn-helix 的結(jié)構(gòu)，也可以作為核蛋白的可能性的證據(jù)。作為核心蛋白都含有幾個不同的結(jié)構(gòu)域，分析ORF059 蛋白中包含至少3 個結(jié)構(gòu)域，符合核心蛋白的結(jié)構(gòu)條件。

本研究的ORF059 蛋白就是山羊痘病毒核心蛋白之一。該蛋白有255個氨基酸構(gòu)成，在細菌中可以較好的表達，得到大量蛋白，有利于其高級結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能的研究。該蛋白是一種DNA 結(jié)合核心蛋白，因此既是一種核心蛋白，也是一種核蛋白（nucleoprotein）。核蛋白就是與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)，因其最初發(fā)現(xiàn)于細胞核中而得名，其實在細胞核及細胞質(zhì)中都含有。核蛋自在生物的生長和繁殖過程中有著獨特的功能和作用。如包裹基因組防止其被降解，參與基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等的調(diào)節(jié)。核蛋白一般都含有特殊的氨基酸信號序列,起蛋白質(zhì)定向、定位作用.如煙草斑紋病毒與小兒麻痹癥病毒、流行性感冒病毒等動植物病毒本身就是核蛋白［15］，所以核蛋白的研究在動及植物病害的防治及臨床醫(yī)學(xué)上有十分重要意義。