錢思彤，龔秀芳，丁晨曦，胡丹，艾樂樂，諸葛堯堯，王長(zhǎng)軍

1.徐州醫(yī)科大學(xué)，江蘇 徐州 221004；2.解放軍東部戰(zhàn)區(qū) 疾病預(yù)防控制中心，江蘇 南京 210002

豬鏈球菌（Streptococcus suis）是一種重要的人獸共患病病原，屬于鏈球菌屬，為革蘭陽性厭氧菌，該菌感染豬或人可引起腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎、敗血癥等病癥，甚至急性死亡[1-2]。2 型豬鏈球菌是豬鏈球菌35 種血清型中分布最廣、致病力最強(qiáng)的分型，是重要的人獸共患病病原[3]。1998年和2005年，我國(guó)的江蘇蘇中、四川資陽地區(qū)均暴發(fā)了由2 型豬鏈球菌引起的突發(fā)性公共衛(wèi)生事件，共感染200 余人及10 萬余頭豬，患者中首次報(bào)道出現(xiàn)病死率極高的鏈球菌中毒性休克綜合征（streptococcal toxic shock syndrome，STSS），引發(fā)醫(yī)學(xué)界廣泛關(guān)注。2 型豬鏈球菌在嚴(yán)重威脅養(yǎng)豬業(yè)從業(yè)人員健康的同時(shí)，也給社會(huì)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。

2 型豬鏈球菌致病機(jī)制復(fù)雜，涉及毒力因子等介導(dǎo)的細(xì)菌黏附、入侵、定植和擴(kuò)散等各個(gè)方面[5-7]，其中蛋白酶或其他具有催化功能的酶可通過參與細(xì)菌的代謝過程影響其致病性，提高細(xì)菌感染宿主的成功率[8-13]。氨基糖代謝在細(xì)菌的代謝與增殖過程中發(fā)揮重要作用，半乳糖胺/乙酰半乳糖胺（GalN/GalNAc）分解代謝途徑是氨基糖代謝的重要組成部分，而葡萄糖胺-6-磷酸脫氨酶（glucosamine-6-phosphate deaminase，NagB）是參與該代謝途徑的核心代謝酶，它可以將葡萄糖胺-6-磷酸（glucosamine-6-P，GlcN6p）進(jìn)一步分解為果糖-6-磷酸（fruetose-6-P，F(xiàn)-6-P）與氨，這是GalNAc 代謝中的最后一個(gè)步驟，決定了GalNAc代謝的命運(yùn)，同時(shí)它還可通過影響脂多糖合成和細(xì)胞壁氨基糖的回收，影響細(xì)菌細(xì)胞壁的生成[14]。

本課題組在對(duì)2 型豬鏈球菌中國(guó)強(qiáng)毒株05ZYH33 進(jìn)行全基因組測(cè)序和功能注釋時(shí)，發(fā)現(xiàn)ssu05_0195基因與大腸桿菌中葡萄糖胺-6-磷酸脫氨酶編碼基因nagB的序列同源性較高，推測(cè)其可能編碼NagB。在此，我們利用原核表達(dá)系統(tǒng)克隆表達(dá)目的基因nagB，純化獲得了具有生物活性的重組NagB，建立準(zhǔn)確的檢測(cè)方法分析其酶反應(yīng)體系活性，為研究NagB 在2 型豬鏈球菌糖代謝及致病過程中可能發(fā)揮的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

2 型豬鏈球菌05ZYH33 菌株由本室保存，分離自2005年四川資陽豬鏈球菌STSS 患者；表達(dá)載體pET32a 購(gòu)自華大公司；PCR 擴(kuò)增試劑盒、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ、DNA 膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA marker等購(gòu)自TaKaRa公司；High Affinity Ni-Charged Resin FF Pre?packed Column 購(gòu)自金斯瑞公司；GlcN6p、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）、糖磷酸異構(gòu)酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶購(gòu)自Sigma Aldrich 公司；還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）購(gòu)自南京碧云天公司。

PCR 擴(kuò)增儀購(gòu)自Biometra 公司；凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自上海Tanon 公司；TY92-2D 超聲波細(xì)胞破碎機(jī)購(gòu)自寧波新芝公司；UV2550 型紫外分光光度計(jì)購(gòu)自島津公司。

1.2 NagB的原核表達(dá)

1.2.1 pET32a:nagB質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定ssu05_0195（nagB）基因序列單堿基連續(xù)重復(fù)率極高，以05ZYH33 全基因組為模板進(jìn)行簡(jiǎn)單PCR 無法直接擴(kuò)增出目的序列，故將目的基因序列送華大基因公司進(jìn)行優(yōu)化并全合成，獲得目的基因片段。

用BamHⅠ/XhoⅠ內(nèi)切酶分別雙酶切構(gòu)建的pUC57:nagB質(zhì)粒與pET32a 空載體質(zhì)粒，1%瓊脂糖凝膠電泳分離nagB目的片段和線性化的pET32a 片段，DNA 高效連接酶連接后，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 感受態(tài)，挑選陽性單克隆，提取質(zhì)粒。pET32a:nagB質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定正確后，送金唯智公司測(cè)序，分析測(cè)序結(jié)果。

1.2.2 重組NagB的誘導(dǎo)表達(dá)與純化 將重組大腸桿菌BL21/pET32a:nagB接種于LB（含氨芐青霉素）液體培養(yǎng)基中，16℃下IPTG 誘導(dǎo)過夜，離心收集菌體，冰浴條件下超聲波破碎。用Ni 離子親和層析柱純化上清中的目的蛋白，SDS-PAGE 觀察純化程度。重組菌的上清經(jīng)第一次純化后，SDSPAGE 分析表明其中依然含有雜蛋白，將目的蛋白與Ni 離子親和層析柱進(jìn)行二次螯合，二次純化后的蛋白再進(jìn)行SDS-PAGE，查看結(jié)果。

1.2.3 重組NagB的Western 印跡鑒定 重組NagB經(jīng) SDS-PAGE 后轉(zhuǎn)至 PVDF 膜上，4℃封閉 2 h，TBST 清洗 3 次，膜與一抗（1∶1000 稀釋的 His-Tag單抗）孵育過夜，TBST 再清洗，37℃與二抗（1∶5000 稀釋帶HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG）孵育1 h，TBST 清洗后，加入DAB 顯色液顯色曝光。

1.3 NagB體外酶活性檢測(cè)

1.3.1 NagB 酶促反應(yīng)體系活性測(cè)定原理 NagB介導(dǎo)的是GlcN6p的脫氨異構(gòu)反應(yīng)，其酶活性定義為25℃下，每分鐘消耗 1 μmol 底物生成1 μmol產(chǎn)物的酶量為1 個(gè)酶單位。由于該反應(yīng)的產(chǎn)物和反應(yīng)物在固定波長(zhǎng)下均無特征紫外吸收，直接利用紫外分光光度法無法檢測(cè)其酶活性。通過查閱文獻(xiàn)[15]，我們最終確定采用酶偶聯(lián)法與紫外分光光度法相結(jié)合的方法來檢測(cè)NagB 酶促反應(yīng)體系的活性。NagB 酶促反應(yīng)的產(chǎn)物是F-6-P，它可以在糖磷酸異構(gòu)酶作用下反應(yīng)生成葡萄糖-6-磷酸，后者在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶作用下將NADP還原為NADPH，NADPH 在340 nm 處有特征紫外吸收，通過測(cè)量反應(yīng)體系的D340nm值的變化量便可確定其中生成的NADPH 量，進(jìn)而確定NagB 酶促反應(yīng)生成的產(chǎn)物量，測(cè)定其反應(yīng)體系的酶活性。

1.3.2 NagB 酶促反應(yīng)體系活性測(cè)定方法 根據(jù)NagB 酶促反應(yīng)體系活性的測(cè)定原理確定其檢測(cè)方法。在總體積為1 mL的Tris-HCl 緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，pH9.5）中構(gòu)建反應(yīng)體系，包括GlcN6p 15 mmol/L、重組NagB 0.15 μg、糖磷酸異構(gòu)酶4 U、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶1.5 U、NADP 0.2 mmol/L。

酶促反應(yīng)結(jié)束后，體系置于沸水中5 min 終止反應(yīng)，檢測(cè)反應(yīng)體系的D340nm值，通過吸光度值的增加量計(jì)算反應(yīng)生成的產(chǎn)物量。按下式計(jì)算NagB 酶促反應(yīng)體系的活性：

酶活性（U/mL）=［（D340nm+b）/a］×2000/40

其中，2000 為將0.5 μL 稀釋酶液中的酶活性折算為 1 mL的酶活性，40 為反應(yīng)時(shí)間 40 min，a與b為標(biāo)準(zhǔn)曲線系數(shù)。

1.3.3 NADPH-光密度標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定 NADPH 在340 nm 處有特征紫外吸收，配制不同濃度（濃度分別為0、0.08、0.1、0.12、0.14、0.16、0.18 mmol/L）的NADPH 溶液，定容至1 mL，各取200 μL，測(cè)定D340nm值，做NADPH 光密度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 NagB 酶促反應(yīng)體系最適溫度確定 為確定反應(yīng)溫度對(duì)NagB 酶促反應(yīng)體系活性的影響，在pH9.5、反應(yīng)時(shí)間40 min 條件下，分別測(cè)定溫度為16℃、20℃、25℃、30℃、37℃、42℃、50℃、60℃、70℃時(shí)的酶反應(yīng)體系活性，以確定其最適反應(yīng)溫度。

1.3.5 NagB 酶促反應(yīng)體系最適反應(yīng)時(shí)間確定 為探究NagB 酶促反應(yīng)體系的最適反應(yīng)時(shí)間，在溫度25℃、pH9.5的條件下，分別測(cè)定反應(yīng)時(shí)間為10、20、30、40、50、60、90 min 時(shí)的 NagB 酶促反應(yīng)體系活性，以確定其最適反應(yīng)時(shí)間。

1.3.6 NagB 酶促反應(yīng)體系最適pH 確定 為探究pH 對(duì)NagB 酶促反應(yīng)體系活性的影響，利用鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)緩沖液pH 至固定值，在25℃、反應(yīng)時(shí)間40 min 條件下，分別測(cè)定 pH 為 3、3.7、6、7、7.5、8、9、9.5、10、10.5 時(shí) NagB 酶促反應(yīng)體系的活性，以確定其最適pH。

1.3.7 底物濃度對(duì)NagB 酶促反應(yīng)體系活性的影響 底物濃度能影響酶促反應(yīng)速率，為探索底物濃度對(duì)NagB 酶促反應(yīng)體系活性的影響，在25℃、反應(yīng)體系pH9.5 條件下，分別測(cè)定底物濃度為1、5、8、10、13、15、18、20 mmol/L 時(shí) NagB 酶促反應(yīng)體系的活性，以確定其最適底物濃度。

1.3.8 NagB 酶促反應(yīng)體系中動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定 在25℃、pH9.5 條件下，通過測(cè)定不同濃度的GlcN6p底物對(duì)應(yīng)的D340nm值，確定其反應(yīng)速率。根據(jù)雙倒數(shù)做圖法將米氏方程改寫，計(jì)算NagB 酶促反應(yīng)體系所對(duì)應(yīng)的米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vmax。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)載體pET32a:nagB的酶切驗(yàn)證

pET32a:nagB質(zhì)粒與pET32a 空載質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1。pET32a:nagB重組質(zhì)粒雙酶切后得到2條帶，其中1200 bp 左右的為目的基因條帶；測(cè)序結(jié)果也表明該片段與2 型豬鏈球菌05ZYH33 株的NagB 編碼基因ssu05_0195的優(yōu)化序列一致，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 重組NagB的表達(dá)與純化

2.2.1 重組NagB的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定 分別取10 μL 大腸桿菌BL21/pET32a 誘導(dǎo)、未誘導(dǎo)菌液，以及重組大腸桿菌BL21/pET32a:nagB的誘導(dǎo)、未誘導(dǎo)菌液進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果如圖2，可以明顯觀測(cè)到重組菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性條帶（相對(duì)分子質(zhì)量約為56×103）。

16℃過夜誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌經(jīng)超聲波破碎離心分離后，上清與沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE，發(fā)現(xiàn)目的蛋白主要表達(dá)于上清中，僅有不到10%的目的蛋白以包涵體形式表達(dá)，顯示目的蛋白主要以可溶性形式存在（圖3）。

2.2.2 重組 NagB的純化 重組 NagB帶6×His標(biāo)簽，利用鎳離子親和層析柱對(duì)上清表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行2 次純化（1 次純化后存在雜蛋白），最終獲得的純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE 鑒定，顯示為單一特異性蛋白條帶（圖2泳道5）。

2.2.3 重組NagB的Western 印跡 重組NagB的N端帶有6×His 標(biāo)簽，利用抗His-Tag 單抗能夠有效地鑒定重組蛋白。Western 印跡（圖4）顯示，NagB泳道在相對(duì)分子質(zhì)量約56×103處有明顯的蛋白印跡帶，與純化的NagB 大小相同，證實(shí)NagB 獲得誘導(dǎo)表達(dá)并純化。

2.3 NagB酶促反應(yīng)體系活性檢測(cè)

NADPH-光密度標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5。

2.3.1 溫度對(duì)NagB 促反應(yīng)體系活性的影響 在pH9.5、反應(yīng)時(shí)間40 min 條件下，當(dāng)溫度低于25℃時(shí)，NagB 酶促反應(yīng)體系活性隨溫度的升高而升高，25℃時(shí)達(dá)到峰值，此后逐漸下降，推測(cè)NagB 酶促反應(yīng)體系最適反應(yīng)溫度約為25℃（圖6）。

圖1 pET32a:nagB重組質(zhì)粒的酶切鑒定

圖2 SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)和純化

圖3 重組NagB的可溶性表達(dá)鑒定

圖4 重組NagB的Western印跡

圖5 NADPH-光密度標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)NagB 酶促反應(yīng)體系活性的影響 在pH9.5、溫度為25℃的條件下，反應(yīng)時(shí)間為10～40 min 時(shí)，NagB 酶促反應(yīng)速度隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為40 min 時(shí)反應(yīng)速度達(dá)最大值，酶促反應(yīng)飽和，推測(cè)NagB 酶促反應(yīng)體系的最適反應(yīng)時(shí)間約為40 min（圖7）。

2.3.3 pH 對(duì)NagB 酶促反應(yīng)體系活性的影響 在溫度25℃、反應(yīng)時(shí)間40 min 條件下，在堿性條件下NagB 酶促反應(yīng)體系的活性遠(yuǎn)高于酸性條件，pH9.5 時(shí)顯示最大活性（圖8）。

2.3.4 底物濃度對(duì)NagB 酶促反應(yīng)體系活性的影響 在pH9.5、溫度為25℃的條件下，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?1～15 mmol/L 時(shí)，NagB 酶促反應(yīng)體系的反應(yīng)速度隨底物濃度的增加而提高，底物濃度為15 mmol/L 時(shí)NagB 酶促反應(yīng)達(dá)到飽和，考慮相關(guān)成本因素，默認(rèn)底物濃度為15 mmol/L 時(shí)NagB 酶促反應(yīng)體系活性最大（圖9）。

圖6 反應(yīng)溫度與NagB酶促反應(yīng)體系活性關(guān)系

圖7 反應(yīng)時(shí)間與NagB酶促反應(yīng)體系活性關(guān)系

圖8 pH與NagB酶促反應(yīng)體系活性關(guān)系

圖9 底物GlcN6p濃度與NagB酶促反應(yīng)體系活性關(guān)系

2.3.5 NagB 酶促反應(yīng)體系的酶活性測(cè)定 根據(jù)NADPH-光密度標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖5）與NagB 酶促反應(yīng)體系的活性計(jì)算公式，可得純化后的2 型豬鏈球菌NagB 酶促反應(yīng)體系的體外酶活為3.73 U/mL，通過One-Drop 測(cè)定純化后的重組NagB 含量為0.3 mg/mL，計(jì)算可得酶比活為12.43 U/mg。

2.3.6 NagB 酶促反應(yīng)體系的酶學(xué)動(dòng)力學(xué)分析 根據(jù)NagB 酶促反應(yīng)體系活性定義及米氏方程的改寫式，NagB 酶促反應(yīng)體系中酶活動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km為7.02 mmol/L，Vmax為0.02 mmol/L。

3 討論

氨基糖代謝在細(xì)菌代謝與增殖中發(fā)揮重要作用，而GalN/GalNAc 分解代謝途徑是氨基糖代謝中的重要組成部分，NagB 則是GalN/GalNAc 分解代謝途徑中的核心代謝酶，可使GlcN6p 脫氨異構(gòu)為F-6-P，產(chǎn)物進(jìn)入糖代謝途徑發(fā)揮作用，是脂多糖合成和細(xì)胞壁氨基糖回收的重要步驟[16-18]。

本課題組在進(jìn)行05ZYH33 全基因組注釋時(shí)發(fā)現(xiàn)基因ssu05_0195可能編碼NagB。基于此，本研究構(gòu)建了重組大腸桿菌BL21/pET32a:nagB，誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，并通過2 次純化獲得了純度較高且具有生物活性的重組NagB。

采用酶偶聯(lián)與紫外分光光度法相結(jié)合的方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)2 型豬鏈球菌來源的重組NagB 具有酶活性，酶反應(yīng)體系的最適反應(yīng)溫度為25℃，最佳反應(yīng)時(shí)間為40 min，最適反應(yīng)pH 為9.5，最佳底物濃度為15 mmol/L。在最適反應(yīng)條件下，重組表達(dá)的NagB 酶反應(yīng)體系活性為3.73 U/mL，酶比活為12.43 U/mg。此結(jié)果較2 型豬鏈球菌來源的NagA[19]和BgaC[20]的酶活性偏低，推測(cè)可能與其復(fù)雜的反應(yīng)體系有關(guān)。NagB 酶促反應(yīng)體系活性受偶聯(lián)反應(yīng)中其他酶活性制約，只能通過控制變量的方法篩選出最優(yōu)反應(yīng)條件，測(cè)得的活性是NagB 酶促反應(yīng)體系的活性，而不是單純的NagB酶的活性，故相對(duì)較低。不過有研究者以類似方法檢測(cè)過枯草芽孢桿菌IG20 株NagB 酶促反應(yīng)體系的活性，結(jié)果處在相似水平[9]。

綜上，我們克隆表達(dá)了2 型豬鏈球菌中葡萄糖胺-6-磷酸脫胺酶的編碼基因，并測(cè)定了其重組蛋白的酶反應(yīng)體系活性，為進(jìn)一步分析NagB 在2 型豬鏈球菌糖代謝及后續(xù)感染致病過程中的作用奠定了基礎(chǔ)。