王光裕 陳敏 洪南 王升啟 廖萬清 楊英

(1.軍事醫(yī)學研究院輻射醫(yī)學研究所，北京 100850；2.上海市醫(yī)學真菌分子生物學重點實驗室；上海長征醫(yī)院皮膚科，上海 200003；3.北京市藥品檢驗所，北京 100035)

近年來，隨著廣譜抗生素、免疫抑制劑和糖皮質激素在臨床的大量使用，腫瘤、艾滋病、骨髓移植和器官移植等免疫缺陷患者繼發(fā)侵襲性真菌感染(invasive fungal infections，IFI)的病例數量不斷上升，有研究表明，侵襲性真菌感染患者的死亡率超過50%[1,2]，早期確診對于治愈患者、降低死亡率有非常重要的意義。

傳統(tǒng)的真菌實驗室診斷方法包括真菌鏡檢、培養(yǎng)以及組織病理學檢查等。分子診斷技術的快速發(fā)展為IFI的診斷帶來了一場分子微生物學革命，通過對疾病早期病原體的微量核酸進行檢測，能快速進行鑒定，從而指導治療。與傳統(tǒng)方法相比，分子診斷技術大大縮短了診斷所需時間，敏感性和特異性也大幅提高，且操作簡便，易于重復，有利于規(guī)范化，為IFI的快速診斷提供了新的思路[3-5]。

本病案為1例臨床上難以判定病因的腦膜炎患者，曾考慮代謝性疾病、脫髓鞘疾病或結核性腦膜炎，但相應治療效果不明顯。后考慮為隱球菌感染可能，經腦脊液墨汁染色未發(fā)現(xiàn)典型的隱球菌莢膜特征；進行多次微生物培養(yǎng)，均未成功。最后通過對腦脊液樣本直接提取DNA進行PCR和DNA芯片的快速檢測，確定腦脊液中有隱球菌感染，并指導臨床用藥，使患者病情緩解。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

樣本 患者腦脊液樣本由長征醫(yī)院提供。

試劑 DNA提取試劑(美國Zymo公司，ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrepTM)。PCR實驗相關試劑：PCR Mix(捷瑞生物工程有限公司)；ITS引物(捷瑞生物工程有限公司)，ITS4序列為5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，ITS5序列為5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'；瓊脂糖(美國 Lonza公司)；50×TAE(天根生化科技有限公司)。DNA芯片相關試劑耗材：醛基化玻片(上海百傲科技有限公司)；雜交液(組分為：4×SSC，0.3% SDS，5%甲酰胺，5×Denhardt)。銀染試劑：顯色A液(醋酸銀的水溶液，濃度4 mg/mL)；顯色B液(氫醌的檸檬酸緩沖液溶液，濃度10 mg/mL)。標記液：Streptavidin-HRP(Sigma)與稀釋液(1×BS+0.1%BSA)按照1∶1000的比例進行稀釋得到。量子點工作液：Streptavidin-Nanogold原液(Nanoprobes)與稀釋液(1×PBS+0.1%BSA)按照1∶40的比例稀釋。底物液：Biotin-Tyramine與稀釋液(1×PBS+0.1%BSA)按照1∶500的比例進行稀釋。5mL 50×Denhardts試劑：取50mg BSA、50mg Ficoll和50mg PVP，加5 mL水溶解，混勻。PBS緩沖液：800 mL水中溶解8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，用HCl調節(jié)pH值至7.4，加水定容至1 L，高壓滅菌，保存于室溫。10% SDS：10 g SDS用去離子水溶解，定容至100 mL。20×PBST：取160 g NaCl，4g KCl，28.8 Na2HPO4，4.8 g KH2PO4，10 mL吐溫20，加水至1000 mL，振蕩混勻。20×SSC：稱取175.2g NaCl, 88.2 g檸檬酸鈉，溶于800 mL去離子水中，加入數滴10 mol/LNaOH溶液，調節(jié)PH至7.0，加去離子水定容至1L，分裝后滅菌，10×SSC、5×SSC、1×SSC可由20×SSC做相應稀釋得到。

儀器 全自動樣本快速研磨儀(中國上海凈信科技有限公司)；離心機(美國Thermo公司)；渦旋振蕩器(中國其林貝爾公司)；恒溫金屬浴(中國卡尤迪公司)；NanoDrop分光光度計(德國IMPLEN公司)；Qubit 2.0 熒光計(美國Thermo Fisher公司)；E-gel凝膠電泳系統(tǒng)(美國Thermo Fisher公司)；PCR儀(美國ABI公司)；電泳儀(中國北京六一儀器廠)；凝膠成像儀(美國BIORAD公司)；芯片點樣儀(Pix Sys 5000 Cartesian Technologies)；基因芯片掃描儀(GenePix 4000B Axon Instruments)；生物芯片便攜式可視化芯片掃描儀(全軍傳染病分子診斷新技術重點實驗室研制)。

1.2 方法

樣本DNA提取 從腦脊液中提取總DNA：向ZR BashingBeadLysis Tube (0.1 mm&0.5 mm)中加入200 μL腦脊液，再加入750 μL Lysis Solution，按照試劑盒說明書操作。

PCR檢測ITS序列 PCR擴增：PCR體系(Mix 12.5 μL，引物各0.5 μL，ddH2O 10.5 μL，模板1 μL)。擴增條件(95℃預變性4 min后，在95℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 1 min條件下進行30個循環(huán)，72℃延伸7 min)。用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物片段。

DNA芯片制作 針對5種常見機會性感染真菌，選取隱球菌LAC1位點、煙曲霉CYP51A位點、白念珠菌SAP6位點、馬爾尼菲籃狀菌GASC位點、耶氏肺孢子菌18S位點作為檢測序列[6]，針對其保守區(qū)設計引物探針，最終篩選出了5對引物見表1，5條探針用于真菌檢測見表2。

表1 本研究使用的引物信息及序列

表2 本研究篩選后的探針信息及序列

Multiplex RT-PCR反應條件 預變性95℃反應10 min,變性94℃反應30 s,退火溫度52℃反應30 s，退火溫度72℃反應30 s，設定45個循環(huán)，終延伸72℃反應5 min。

DNA芯片的雜交、洗滌及可視化檢測 雜交及洗滌:PCR產物98℃熱變性5 min，冰浴5 min，與雜交液等體積混合，取10 μL加至各反應區(qū)將芯片置于雜交盒，浸入45℃水浴中雜交1 h。雜交后的芯片依次在洗液A(1×SSC，0.2%SDS)，洗液B(0.2×SSC)和洗液C(0.1×SSC) 中于室溫各洗滌20 s，置室溫晾干。可視化檢測：①在芯片反應區(qū)加入10 μL辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素(streptavidin-HRP)，37℃水浴放置30 min；取出后用PBST洗液清洗20 s，重復3次，置室溫晾干。②在芯片反應區(qū)加入10 μL的生物素—酪胺(biotin-tyramine)，37℃水浴放置30 min，用PBST洗液清洗20 s，重復3次，置室溫晾干。③在芯片反應區(qū)加入10 μL Nanoprobes，37℃水浴放置30 min；取出后用PBST洗液清洗20 s，重復3次，用去離子水沖洗，置室溫晾干。④將銀染試劑A液和B液等體積混合，每個芯片反應區(qū)立即避光加入混合液30 μL，待芯片上出現(xiàn)明顯可視化信號后停止顯色，用去離子水清洗，晾干。芯片雜交信號使用便攜式可視化生物芯片掃描儀進行掃描，用ArrayVision7.0軟件分析結果。

2 結 果

2.1 常規(guī)檢查

患者腦CT顯示右側腦膜有個白色的小亮點，疑似真菌感染形成的肉芽腫。腦脊液墨汁染色在40倍顯微鏡下發(fā)現(xiàn)疑似隱球菌孢子，但沒有莢膜，與常見引起腦膜炎的新生隱球菌的形態(tài)有所差別。

2.2 腦脊液樣本提取總DNA行分子診斷結果

PCR 電泳 將患者腦脊液提取的DNA進行ITS序列的擴增，其瓊脂糖電泳圖中見患者樣本和陽性對照在600 bp左右都有明顯條帶，陰性對照沒有條帶。見圖1。

DNA芯片結果 將患者腦脊液提取的DNA進行芯片檢測，在新生隱球菌列顯示陽性結果，見圖2。

3 討 論

ITS序列是真菌核糖體DNA序列間隔區(qū)的高度保守序列，可以依此設計引物，將擴增產物作為DNA Marker來判定樣本中是否存在真菌以及真菌的種屬鑒定[7]。該技術已在真菌實驗室診斷中較廣泛應用，Rivera等[8]采用巢式PCR技術對隱球菌的鑒定可以達到飛摩爾(fmol)級別，具有高度的靈敏性和特異性。生物芯片技術自上世紀90年代進入快速發(fā)展的階段，至今已在諸多領域已得到廣泛地應用，它可在平方厘米大小的固相介質表面或液相介質中用微加工技術構建分析系統(tǒng)，根據分子間相互作用的原理，實現(xiàn)對核酸、蛋白質等分子的快速、特異、高通量和自動化檢測，在病原微生物的感染診斷、基因分型、耐藥檢測等方面應用廣泛，已有多種生物芯片產品用于臨床診斷[6,9]。

圖1ITS序列的電泳圖譜： “M”為DNA的marker；“-”為陰性對照；“Y”為患者樣本；“+”為新生隱球菌陽性對照；“N”為空孔圖2患者腦脊液提取的DNA在基因芯片上的檢測結果

Fig.1Electropherogram of ITS sequences：“M” is DNA marker；“-” is Negative control; “Y” is the patient sample; “+” is theCryptococcusneonatal positive control; “N” is the empty holeFig.2Detection of DNA extracted from cerebrospinal fluid in patient on gene chips

本文患者腦脊液直接提取的DNA經過PCR擴增ITS序列，其電泳圖中有與隱球菌陽性對照相對應的條帶，可以初步斷定其中有隱球菌的存在。但由于腦脊液墨汁染色未查見典型的隱球菌形態(tài)，所以又將腦脊液樣本DNA進行了芯片檢測分析進一步確證為隱球菌。

隱球菌腦膜炎診斷明確后，予兩性霉素聯(lián)合氟胞嘧啶及伏立康唑聯(lián)合抗真菌治療約10 d后，患者意識逐漸恢復，復查腦脊液壓力、腦脊液蛋白逐漸降低，復查頭顱MRI亦提示異常信號較前明顯降低，考慮抗真菌治療有效，繼續(xù)予聯(lián)合抗真菌治療約6個月后停止抗真菌治療。目前患者一般情況好，未訴頭痛等異常癥狀，復查腦脊液及頭顱MRI亦未見異常。

分子診斷技術為侵襲性真菌感染病原體的快速診斷提供了可能，基因芯片具有靈敏度高、通量高、多種微生物同時檢測等特點，試驗可在5 h內完成，對于用傳統(tǒng)檢驗不能明確診斷的疑難、復雜感染病癥的診斷有非常廣闊的應用前景。