余甜 林賦桂 胡立冬 李可可 陳曉青 謝躍 時文靜 魏蓮花

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，蘭州 730000；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750021；3.廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廈門 361005；4.甘肅省人民醫(yī)院臨檢中心，蘭州 730000)

近年來，隨著影響免疫功能疾病如腫瘤、艾滋病等疾病發(fā)病率上升，臨床真菌感染率也呈明顯上升趨勢，尤其是侵襲性真菌及深部真菌感染率[1]。在兒童患者中，因侵襲性真菌病(invasive fungal disease，IFD)而導(dǎo)致死亡率在10%～70%左右，在特定人群中發(fā)病率更高，如播散性IFD患者、血液病腫瘤等[2]。目前美國已將白念珠菌列為住院患者第3大常見血流感染病原體，死亡率高達(dá)50%，為患者和社會帶來了沉重的健康和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3-4]。由于侵襲性真菌的臨床表征不明確，易被基礎(chǔ)疾病掩飾，因此實(shí)驗(yàn)室診斷尤其重要。歐洲癌癥研究和治療組織/侵襲性真菌感染協(xié)作組(EORTC/IFICC)和美國真菌病研究組(MSG)所制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)也將真菌學(xué)證據(jù)定為確診證據(jù)[5]。常規(guī)實(shí)驗(yàn)室鑒定真菌流程：首先進(jìn)行直接鏡檢根據(jù)菌體形態(tài)判定菌屬，這是最直接也是最有效的方法，常用KOH法、熒光染色法、膠紙粘貼法等。絕大多數(shù)標(biāo)本需要培養(yǎng)后進(jìn)行鑒定，根據(jù)菌落形態(tài)以及生化反應(yīng)鑒定，如顯色培養(yǎng)基、API鑒定條、酵母菌的自動化鑒定儀等。而對于絲狀真菌主要通過不同染色方法對菌體染色后根據(jù)形態(tài)進(jìn)行鑒定。常規(guī)流程鑒定真菌所需的時間通常在3～4 d，對實(shí)驗(yàn)室人員的技術(shù)要求高，成本昂貴，難以鑒定不常見或者生化反應(yīng)相近的菌株[6]。除此之外，真菌鑒定還可通過檢測抗原、或分子生物學(xué)方法鑒定，但主要存在技術(shù)難度大、以及靈敏度不高等問題。

基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)(MALDI-TOF MS)可在短時間內(nèi)提供可靠的微生物鑒定結(jié)果，可鑒定的菌種現(xiàn)可以達(dá)到3000多種，在真菌鑒定方面有快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)[7]。其主要原理為：將樣本與基質(zhì)液制備成均勻晶體附著在靶板上，通過質(zhì)譜中的激光使其電解，電離樣品在真空電場中因其不同的質(zhì)荷比而分離，形成不同的蛋白指紋圖譜，通過和數(shù)據(jù)庫中的質(zhì)譜圖譜進(jìn)行比對未知真菌進(jìn)行鑒定。本研究的目的是基于循證醫(yī)學(xué)的方法評價MALDI-TOF MS鑒定臨床分離真菌的準(zhǔn)確性，與傳統(tǒng)方法的準(zhǔn)確度對比，為臨床實(shí)驗(yàn)室選擇適當(dāng)?shù)臋z驗(yàn)手段提供可靠的資料。

1 材料與方法

1.1 檢索策略

檢索英文數(shù)據(jù)庫PubMed，Web of Science，Cochrane Laboratory，英文檢索策略：maldi-ms[MeSH Term]，MALDI-TOF MS，matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry，spectrometry mass matrix assisted laser desorption-ionization，；Fungi [MeSH Term]，F(xiàn)ungus，identification，detection等。中文數(shù)據(jù)庫：CBM、萬方、維普、知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫，相應(yīng)的檢索策略詞：關(guān)鍵詞“質(zhì)譜”、“飛行質(zhì)譜”、“MALID-TOF-MS”、“真菌”、“鑒定”、“分型”、“診斷”，檢索時間為 2018年5月，檢索語言包括但不限于中文和英文發(fā)表的評價飛行質(zhì)譜和臨床常規(guī)方法鑒定臨床分離真菌的相關(guān)文獻(xiàn)。

1.2 研究選擇

納入和排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：文獻(xiàn)同時使用常規(guī)方法和MALDI-TOF MS鑒定真菌并統(tǒng)計其正確率的文獻(xiàn)；納入研究菌株數(shù)量大于等于80株非重復(fù)菌株；納入研究中必須包含至少一種金標(biāo)準(zhǔn)檢測真菌方法，包括但不限于測序、PCR等分子生物學(xué)手段；納入研究中包括前瞻性研究和回顧性研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：納入文獻(xiàn)中菌株來源限定為臨床分離菌株，排除來源于工業(yè)、環(huán)境、以及動植物的真菌；排除在MALDI-TOF MS鑒定過程中使用創(chuàng)新方法，例如修改MALDI-TOF MS鑒定中樣本預(yù)處理過程，樣本直接使用陽性培養(yǎng)瓶或尿液等；排除在鑒定過程中使用非商業(yè)數(shù)據(jù)庫的文獻(xiàn)。

文獻(xiàn)篩查和質(zhì)量評價由兩名研究者獨(dú)立按照納入與排除標(biāo)準(zhǔn)篩選文獻(xiàn)，任何分歧均以協(xié)商方式解決。使用修訂后的QUADAS(quality assessment for studies of diagnostic accuracy,QUADAS)評價文獻(xiàn)質(zhì)量，包括研究設(shè)計、菌株的類別和地理分布、盲態(tài)、參考方法、閾值、參考方法和系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫等。

數(shù)據(jù)提取數(shù)據(jù)時，包括飛行MALDI-TOF MS和常規(guī)方法在種、屬水平正確鑒定菌株數(shù)和總鑒定分離株的數(shù)目(排除參考質(zhì)譜圖庫中缺少被鑒定菌株的數(shù)據(jù))。分別收集不同菌株的種類(酵母菌、絲狀真菌)，質(zhì)譜的型號、鑒定閾值等。此外，還提取了以下信息：第一作者，出版年份，研究設(shè)計(前瞻性或回顧性)，臨界值，菌株地理分布，是否為盲態(tài)、參考方法。我們將菌株鑒定的參考閾值設(shè)定為<1.7不可靠鑒定，≥2.0鑒定至種，分?jǐn)?shù)在1.7～1.9之間鑒定至屬。

統(tǒng)計學(xué)分析使用R軟件meta和metafor程序包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，將MALDI-TOF MS和傳統(tǒng)方法正確率作為有效分析統(tǒng)計量。在合并正確率時，分別對MALDI-TOF MS鑒定真菌數(shù)據(jù)(反正弦轉(zhuǎn)換)和常規(guī)方法(對數(shù)轉(zhuǎn)換)使其符合正態(tài)分布[8]。使用Cochran's Q檢驗(yàn)和I2來評價文獻(xiàn)異質(zhì)性，分析異質(zhì)性來源使用亞組分析包括：菌株類別、研究類型、儀器型號、數(shù)據(jù)庫、以及金標(biāo)準(zhǔn)使用范圍等，使用Meta回歸分析計算亞組合間正確率是否有統(tǒng)計學(xué)意義。同時使用隨機(jī)模型對MALDI-TOF MS方法和常規(guī)方法進(jìn)行的敏感性分析；使用Begg和Egger’s法檢測發(fā)表偏倚。

2 結(jié) 果

2.1 檢索結(jié)果

使用上述檢索策略初步檢索到1491條相關(guān)文獻(xiàn)，剔除重復(fù)文獻(xiàn)后剩余1154條記錄。通過閱讀文獻(xiàn)標(biāo)題及摘要排除914篇文獻(xiàn)。其中研究目的不符合的文獻(xiàn)有760篇，會議論文或者綜述116篇，缺少摘要或者病例報道等有38篇。通過閱讀文獻(xiàn)依據(jù)納入排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步進(jìn)行篩選，其中研究目的不符合共有29篇，研究對象不符合納入排除或者研究數(shù)量小于80株的共46篇，研究方法不符合排除納入標(biāo)準(zhǔn)共103篇，缺少金標(biāo)準(zhǔn)或者未使用常規(guī)方法共43篇，最終共篩選出了19篇文獻(xiàn)。文獻(xiàn)主要信息見表1：在19項(xiàng)入選研究中，7項(xiàng)(36.84%)為前瞻性研究，14項(xiàng)(73.68%)為回顧性研究。只有3篇(15.79%)文章明確指出金標(biāo)準(zhǔn)鑒定全部標(biāo)本。15項(xiàng)研究包含鑒定酵母菌，7項(xiàng)研究包含絲狀真菌鑒定。

2.2 Mate分析結(jié)果

在納入的19篇文獻(xiàn)中，共有6609株真菌(酵母菌4741和絲狀真菌1868株)，其中有14篇文獻(xiàn)中提供了常規(guī)方法鑒定真菌數(shù)據(jù)。在隨機(jī)效應(yīng)模式和固定效應(yīng)模式中分別合并MALDI-TOF MS鑒定臨床分離真菌至種(見圖1)和常規(guī)方法鑒定至種(見圖2)，MALDI-TOF MS鑒定臨床分析真菌至種水平的正確率在(90%～100%)、常規(guī)方法鑒定至種正確率在(67%～100%)，合并MALDI-TOF MS鑒定真菌至種(Q=238.38[P<0.0001],I2=92.9%[95%CI=90.2%～94.8%])；常規(guī)方法鑒定至種水平(Q=211.18[P<0.001] ,I2=92.4%[95%CI=89.4%～94.6%])均發(fā)現(xiàn)較大的異質(zhì)性。隨機(jī)效應(yīng)模式中，MALDI-TOF MS鑒定真菌至種的正確率0.9368(95%CI=0.9091～0.9598)，常規(guī)方法鑒定真菌至種的正確率為0.9104(95%CI=0.8874～0.9340)。

表1 納入Mate分析文獻(xiàn)主要特征

注：爭議標(biāo)本是指待評價實(shí)驗(yàn)MALDI-TOF MS和參考實(shí)驗(yàn)常規(guī)鑒定方法(包括形態(tài)學(xué)、生化反應(yīng)等)鑒定結(jié)果不一致的標(biāo)本。

2.3 亞組分析

MALDI-TOF MS將臨床分離真菌鑒定至種水平的正確率做一個亞組分析，分析結(jié)果見表2，主要包括菌株類型、研究類型、金標(biāo)準(zhǔn)檢測標(biāo)本范圍、評分閾值、以及儀器型號等。在亞組分析中，除了金標(biāo)準(zhǔn)檢測的全部標(biāo)本組之外其他亞組異質(zhì)性沒有出現(xiàn)明顯下降。添加金標(biāo)準(zhǔn)檢測范圍后，異質(zhì)性從整體(Q=120.46 [P<0.001],I2=86.7%[95%CI= 80.2%; 91.1%)下降至(Q=5.82[P=0.1204],I2=48.5[95%CI =0.0-82.9]，除此之外，在評分閾值亞組加入時，Vitek-MS推薦的百分比評分方式異質(zhì)性出現(xiàn)了明顯下降(Q=10.68 [P=0.0581],I2=53.2 [95%CI =0～81.3]。我們利用Meta回歸分析比較亞組之間的鑒定正確率是否有統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果表明：Vitek-MS和布魯克公司儀器、不同鑒定閾值、樣本處理方法等因素亞組之間正確率具有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異。對MALDI-TOF MS鑒定真菌至種和常規(guī)方法鑒定至種的全部研究進(jìn)行的敏感性分析，通過逐一省略一項(xiàng)研究的方法，結(jié)果所示(見圖3、4)：沒有任何個體研究對物種水平的合并正確率有任何明顯的影響。

表2 亞組情況表

圖1飛行質(zhì)譜鑒定真菌至種正確率的森林圖圖2常規(guī)方法鑒定臨床分離真菌至種正確率的森林圖圖3常規(guī)方法鑒定至種的敏感性分析圖4質(zhì)譜方法鑒定至種的敏感性分析

Fig.1Forest plot for the meta-analysis of the overall identification ratio at the species level by MALDI-TOF MSFig.2Forest plot for the meta-analysis of the overall identification ratio at the species level by conventional identificationFig.3Influence analysis for the enrolled articles at the species level by Conventional identificationFig.4Influence analysis for the enrolled articles at the species level by MALDI-TOF MS

2.5 發(fā)表偏倚

將納入MALDI-TOF MS鑒定至種的文獻(xiàn)和常規(guī)方法鑒定至種的文獻(xiàn)進(jìn)行了發(fā)表偏倚分析，分別采用Begg和Egger’s檢驗(yàn)是否存在發(fā)表偏倚分析，結(jié)果表明MALDI-TOF MS鑒定真菌至種無發(fā)表偏倚(Begg[z= -0.37905；P= 0.7047]; Egger’s[ t= -0.82114;P= 0.4236])，常規(guī)方法鑒定真菌至種有一定的發(fā)表偏倚(Begg[z=-3.5426;P=0.0003963]; Egger’s[t=-5.7959 ;P= 3.527e-05])。

3 討 論

飛行質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF MS)是一種從蛋白質(zhì)組學(xué)水平鑒定病原微生物的技術(shù)，它具有快速、高效、經(jīng)濟(jì)等多項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)。本研究納入19篇原始研究比較MALDI-TOF MS和常規(guī)方法鑒定臨床分離真菌的準(zhǔn)確度，通過合并單一率的薈萃分析方法得出:MALDI-TOF MS鑒定正確率0.95(95%CI=[0.93～0.96]),常規(guī)方法鑒定至種的正確率為0.91(95%CI=0.89～0.93)，這些數(shù)據(jù)可以得出MALDI-TOF MS是現(xiàn)在常規(guī)方法的可靠的替代方法。本研究中，我們MALDI-TOF MS型號對臨床分離真菌正確率分析，其中Vitek-MS表現(xiàn)的比較出色，鑒定真菌至物種水平上正確率0.9684(95%CI=[0.9530～0.9809])，由于沒有直接對三種MALDI-TOF MS儀器型號進(jìn)項(xiàng)雙盲研究并不能直接得出Vitek-MS的準(zhǔn)確率優(yōu)于其他飛行質(zhì)譜系統(tǒng)。Autoflex鑒定的準(zhǔn)確率0.9565(95%CI=[0.8977～0.9910])優(yōu)于Microflex鑒定準(zhǔn)確率0.9231(95%CI= [0.8717～0.9622])，Autoflex是布魯克在Microflex基礎(chǔ)上優(yōu)化及改進(jìn)發(fā)布的一種精確度更高的新型號設(shè)備[9]。

在臨床實(shí)踐過程中，真菌的鑒定難度比酵母菌更加高，常規(guī)方法的研究中可明顯的看出，常規(guī)方法鑒定酵母菌的正確率0.9085(95%CI=[0.8776～0.9406])，而鑒定絲狀真菌的正確率0.8643(95%CI=[0.7959～0.9385])。MALDI-TOF MS鑒定正確率也表現(xiàn)出這一特點(diǎn)，鑒定酵母菌正確率0.9311(95%CI=[0.8902～0.9630])，鑒定絲狀真菌的正確率0.8598 (95%CI=[0.7393～0.9473])，MALDI-TOF MS鑒定絲狀真菌的難度主要原因是絲狀真菌的蛋白質(zhì)提取難度更大，MALDI-TOF MS操作要求渦旋研磨或者玻璃珠等方法處理，同時商業(yè)參考庫中絲狀真菌物種的光譜數(shù)量不足。影響MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果的因素還有菌株蛋白獲取方法，通常有甲酸提取方法和直接涂布在靶板上再滴加甲酸的方法提取，本研究對兩種方法進(jìn)行了亞組分析，結(jié)果表明兩種方法的鑒定正確率有明顯的差異(P=0.0496)。本研究中評價了不同公司評分閾值對鑒定正確率的研究，研究結(jié)果表明：鑒定至種的閾值納入文獻(xiàn)中共有兩種(≥2.0；≥1.8)，適當(dāng)降低評分閾值可以提高鑒定正確率。這一點(diǎn)在鑒定至屬(>1.7)水平也有所體現(xiàn)。在比較合并正確率的比較中，可以明顯看出鑒定至種(≥2.0；≥1.8)的兩種閾值之間無明顯差異(P=0.1126)，而鑒定至種、鑒定至屬、以及百分比評分方式之間正確率是有明顯差異(見表2)。

在臨床研究中，由于缺乏直接的對比，將更精細(xì)的雙變量薈萃分析模型應(yīng)用于臨床病原體鑒定工具的評估通常是不可行的，因此本研究只能采用單一率的Meta分析[10-11]。單一率的薈萃分析的穩(wěn)定性與雙變量薈萃分析的穩(wěn)定性相比，在多數(shù)情況下會出現(xiàn)明顯的異質(zhì)性，正如先前發(fā)表的文獻(xiàn)所證明的一樣[12-14]。本研究從以下幾個臨床原因分析異質(zhì)性來源：①地域分布原因，真菌疾病呈現(xiàn)一定的區(qū)域性[15]，本文中納入的研究主要集中在歐洲、北美洲、以及亞洲的少數(shù)國家，因此菌株類型也有所限制。②研究類型，本文中納入的研究類型大多數(shù)是回顧性研究，僅21.05%研究遵循盲法規(guī)則，這兩者均會降低研究質(zhì)量。③金標(biāo)準(zhǔn)檢測范圍，目前公認(rèn)的金標(biāo)準(zhǔn)是測序，納入研究中僅有3篇文獻(xiàn)使用金標(biāo)準(zhǔn)檢測了全部標(biāo)本，其他研究均只檢測了金標(biāo)準(zhǔn)和常規(guī)方法鑒定結(jié)果出現(xiàn)差異的標(biāo)本，這種情況會過高估計MALDI-TOF MS鑒定真菌的能力。④數(shù)據(jù)庫更新，本研究中排除了自建真菌數(shù)據(jù)庫、以及商業(yè)數(shù)據(jù)庫和自建庫補(bǔ)充的文獻(xiàn)，主要原因是為了MALDI-TOF MS鑒定真菌的正確率具有普遍參考意義，同時也避免了因?yàn)橘|(zhì)譜數(shù)據(jù)庫的巨大差異影響合并正確率的結(jié)果。據(jù)了解，商業(yè)數(shù)據(jù)庫以大約3～6個月的間隔不斷改進(jìn)和更新，本研究中文獻(xiàn)跨度較大因此依舊具有明顯的異質(zhì)性。此外，本文中MALDI-TOF MS鑒定真菌的研究中不存在發(fā)表偏倚，在常規(guī)方法種存在一定的發(fā)表偏倚，主要原因是真菌的鑒定在臨床應(yīng)用方面普及度差、對技術(shù)人員要求高，所發(fā)表文獻(xiàn)中常規(guī)方法鑒定正確率偏高、以及存在發(fā)表偏倚的問題。

MALDI-TOF MS作為一種新型的鑒定病原微生物的全新技術(shù)，具有很多獨(dú)特的優(yōu)勢。尤其是在縮短鑒定周期、節(jié)約成本、以及降低實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員的技術(shù)要求等。目前，MALDI-TOF MS在直接鑒定血培養(yǎng)陽性瓶病原微生物，微生物分型[16]及藥敏實(shí)驗(yàn)等方面[17]。本研究得出的結(jié)論顯示MALDI-TOF MS是一種對臨床分析真菌具有較高鑒定準(zhǔn)確度的技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)是現(xiàn)在臨床常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法的可靠替代技術(shù)。