隋友樂 朱愛軍(通訊作者)

264002中國人民解放軍第一0七醫(yī)院健康管理中心，山東 煙臺(tái)

土荊皮(Cortex Pseudolaricis)藥材系松科植物金錢松的根皮和近根樹皮的干燥品，性辛溫，其醇提物臨床上用于治療手足真菌感染、濕疹、神經(jīng)性皮炎等[1]。研究表明，土荊皮藥材中的二萜酸類是其發(fā)揮抗真菌、抗腫瘤、抗生育作用的主要有效成分[2，3]，其中以土荊皮乙酸的(PAB)含量最高、活性最強(qiáng)[4]。本文探究了土荊皮藥材中土荊皮乙酸的反向高效液相色譜含量測(cè)定方法，與已報(bào)道的方法相比，該方法的優(yōu)勢(shì)有兩方面[5-6]：①采用了超聲波提取法處理供試品，與經(jīng)典的回流提取法相比更方便快捷且提取溫度更低，干擾物質(zhì)提出少且測(cè)得含量明顯高于報(bào)道值；②采用了乙腈-水作為流動(dòng)相，在實(shí)驗(yàn)過程中我們發(fā)現(xiàn)采用該流動(dòng)相分離效果明顯優(yōu)于甲醇-水洗脫系統(tǒng)。

儀器與試藥

高效液相色譜儀：LC-10AT；超聲波清洗器：KQ-500E 型醫(yī)用；電子天平：AB135-S；土荊皮乙酸標(biāo)準(zhǔn)品：購自中國食品藥品檢定研究院；土荊皮藥材；乙醇、乙腈、甲醇、丙酮均為色譜純，水為超純水。

含量測(cè)定

色譜條件：色譜柱：InersilRODS-3(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水-三氟乙酸(500:500:1)；流速1.0 mL/min；柱溫室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm；進(jìn)樣量20 μL。在此色譜條件下[7]，土荊皮乙酸與提取物中其他組分有較好的分離度。對(duì)照品與供試品的保留時(shí)間一致(9.87 min)，對(duì)照品以及供試品的色譜圖，見圖1。

圖1 高效液相色譜圖(t/min)

溶液制備：①供試品溶液制備：精密稱取土荊皮藥材粉末0.456 74 g，置于25 mL 燒杯中，加水5 mL，浸泡2 h，加入90%乙醇10 mL，超聲波提取20 min，過濾，甲醇洗滌(5 mL×3)，合并濾液、洗滌液，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中丙酮定容，即得。②對(duì)照品溶液的制備：精密稱取干燥過的土荊皮乙酸對(duì)照品5.31 mg，置100 mL 容量瓶中，甲醇定容，搖勻，精密吸取1 mL 置10 mL 量瓶中甲醇定容，得濃度5.31 μg/mL的對(duì)照品溶液。

線性關(guān)系考察：分別精密吸取供試品溶液制備項(xiàng)下儲(chǔ)備溶液0.5 mL、1 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL 置 于10 mL量瓶中用甲醇定容，分別得到2.66 μg/mL、 5.31 μ g/mL 、 21.24 μ g/mL 、42.48 μ g/mL、53.10 μg/mL 對(duì) 照 品 溶液。按色譜條件項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以濃度為縱坐標(biāo)，以峰面積為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=0.29×10-3X-0.16×10-3，r=0.999 6。證明土荊皮乙酸在進(jìn)樣濃度2.66～53.1 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取“對(duì)照品溶液的制備項(xiàng)”下供試品溶液，按“色譜條件”項(xiàng)下色譜條件在0、2、4、6、8 h各進(jìn)樣1 次，記錄峰面積，RSD 2.12%(n=5)，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取同一批樣品6份，每份約0.45 g，按“對(duì)照品溶液的制備”項(xiàng)下供試品溶液制備方法處理，精密吸取20 μL，按照“色譜條件”色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，按照“線性關(guān)系考察”項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算測(cè)得量。土荊皮乙酸的測(cè)得量分別為7.88、7.78 μg、7.26 μg、8.08 μg、7.82 μg、7.97 μg，RSD 3.34%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取土荊皮乙酸對(duì)照品溶液(5.31 μg/mL)按“色譜條件”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6 次[8]，20 μL/次，紀(jì)錄峰面積。結(jié)果：RSD=1.35%(n=6)，表明儀器精密度良好。

加樣回收率試驗(yàn)：精密稱取已知含量的土荊皮乙酸的土荊皮9份，加入土荊皮乙酸對(duì)照品溶液10 mL，按照“對(duì)照品溶液的制備”項(xiàng)下方法處理，測(cè)定含量，并計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率98.69%，RSD=1.58%(n=9)，表明本方法回收率良好。

表1 樣品中土荊皮乙酸的含量

樣品含量測(cè)定：樣品提取率測(cè)定按照“溶液制備”項(xiàng)下制備供試品溶液，按照“色譜條件”中的測(cè)定，記錄峰面積，利用線性方程計(jì)算土荊皮乙酸的含量(mg/g)，見表1。

討 論

供試品制備方法的選擇：和藥典及報(bào)道的供試品制備方法相比，本實(shí)驗(yàn)選用了提取效率更高的超聲波提取法，在提高檢測(cè)效率同時(shí)，可有效避免高溫對(duì)土荊皮乙酸的破壞[9]。

色譜條件的選擇：為能在適宜的分析時(shí)間內(nèi)獲得目標(biāo)成分的完全分離，在實(shí)驗(yàn)過程中首先嘗試了甲醇-水洗脫系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)用該流動(dòng)相洗脫時(shí)基線不平穩(wěn)，分離度較差，故嘗試了以乙腈-水-三氟乙酸作為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)在該條件下，基線平穩(wěn)，待測(cè)組分分離良好，故最終確定用乙腈-水-三氟乙酸作為流動(dòng)相。經(jīng)考察，柱溫考察了20～40℃范圍內(nèi)對(duì)分離度的影響不大，故選用室溫。

本文對(duì)采用超聲輔助浸提的方法制備土荊皮供試品，再探究了RP-HPLC法測(cè)定土荊皮中土荊皮乙酸的含量。測(cè)得土荊皮中土荊皮乙酸含量4.27 mg/g，RSD 3.34%，精密度實(shí)驗(yàn)RSD 值2.12%(n=6)，重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)的RSD 值3.34%(n=6)，加樣回收率98.69%，RSD 1.58%(n=9)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法的精密度、穩(wěn)定性、加樣回收率均滿足測(cè)定要求。本研究為土荊皮的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供了依據(jù)，也為其深入開發(fā)利用提供研究基礎(chǔ)。