趙小麗，高 鵬，劉俊華，周鳳蕊，王佳樂，李廣明

（鄭州市第六人民醫(yī)院肝病五科，鄭州450000）

肝癌在我國惡性腫瘤的發(fā)病率中居于高位，盡管目前臨床具有放療、化療及手術(shù)等多種有效方法，但由于原發(fā)性肝癌早期臨床癥狀較為隱匿，確診時患者多存在肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移并多處于晚期，手術(shù)治療的效果顯著降低，而由于放療、化療較大的毒副作用在臨床使用受限[1]。因此，探尋肝癌的侵襲、轉(zhuǎn)移機(jī)制對制訂有效的治療方案具有重要意義。研究[2-3]提示絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶4/（mammalian Ste20-like kinase 4，MST4）對肝癌的預(yù)后不良具有提示作用并可加速腫瘤細(xì)胞的侵襲、生長及轉(zhuǎn)移，還可調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子而介導(dǎo)肝癌的轉(zhuǎn)移和侵襲，而肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)（epithelial mesechymal transitional，EMT）轉(zhuǎn)化可被MST4激活，進(jìn)而增加肝癌嚴(yán)重程度[4]。因此，本研究深入探討了MHCC97H肝癌細(xì)胞中MST4的表達(dá)與癌細(xì)胞增殖、侵襲遷移的關(guān)系，旨在為肝癌的轉(zhuǎn)移、侵襲機(jī)制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 MHCC97H肝癌細(xì)胞系 MHCC97H肝癌細(xì)胞系購買于復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教研室；實驗所用質(zhì)粒均由南京建成生物研究所提供。

1.2 實驗藥品、儀器 胎牛血清及DMEM培養(yǎng)液購于美國 Hyclone 公司；MST4（1：500）、EDTA 消化液（0.02%）及胰蛋白酶（0.25%）購于美國Proteintech公司；Western blot試劑盒及細(xì)胞核蛋白、總蛋白試劑盒購于 Millipore公司；白細(xì)胞介素-2（IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、趨化因子-2（CCL2）ELISA試劑盒及Transwell小室試劑盒均購于南京建成生物研究所；大鼠ERK及大鼠抗人磷酸化ERK多克隆抗體均購于美國上?？党巧锕?；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗大鼠IgG美國BD公司；酶標(biāo)儀購于美國GE公司。

1.3 實驗方法 胎牛血清（10%）高糖DMEN于5%CO2及37℃條件培養(yǎng)箱傳代培養(yǎng)，3 d傳代1次；將MHCC97H肝癌細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，接種于96孔板上培養(yǎng)，分為空白組、高表達(dá)組（MST4轉(zhuǎn)染高表達(dá)）、低表達(dá)組（MST4轉(zhuǎn)染siRNA）。

1.4 指標(biāo)檢測方法 采用ELISA法檢測各組培養(yǎng)24h后上清液中白細(xì)胞介素-2（IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、趨化因子-2（CCL2）。

采用Western-blot法檢測各組的ERK、p-ERK的表達(dá)情況，提取總蛋白后，取20 g總蛋白行SDSPAGE電泳，常規(guī)轉(zhuǎn)膜后5%脫脂奶粉2 h室溫封閉，分別加入大鼠ERK及大鼠抗人磷酸化ERK一抗，次日常規(guī)洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗大鼠IgG，室溫1 h孵育，暗室曝光顯色。

采用MTT實驗檢測3組腫瘤細(xì)胞的增殖能力。取對數(shù)生長期MHCC97H肝癌細(xì)胞，接種于96孔板，每孔約2 000個，每組設(shè)5個平行孔，5%CO2、37℃條件培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后每孔加入5 g/L MTT 10 μL，37℃4 h孵育，棄除上清培養(yǎng)基后每孔加150 μL DMSO，振蕩后酶標(biāo)儀（492 nm波長）檢測吸光度。

采用Transwell實驗檢測各組細(xì)胞的侵襲遷移能力。轉(zhuǎn)染的MHCC97H肝癌細(xì)胞48 h培養(yǎng)后消化，取1×105個細(xì)胞于滅菌EP管（1.5 mL），細(xì)胞重懸后具體操作依據(jù)Transwell小室試劑盒說明書，24 h常規(guī)培養(yǎng)后取出小室，乙醇（95%）固定，結(jié)晶紫染色后取5個視野200倍顯微鏡下觀察侵襲情況并計數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 統(tǒng)計軟件采用SPSS16.0版本，數(shù)據(jù)表述采用±s表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用單因素方差分析法，組間比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組細(xì)胞MST4蛋白表達(dá)比較 高表達(dá)組的MST4蛋白表達(dá)顯著高于空白組和低表達(dá)組（P＜0.05）；空白組和低表達(dá)組的MST4蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

表1 3組細(xì)胞的MST4蛋白表達(dá)水平比較（±s，相對表達(dá)強度）Tab 1 Comparison of MST4 protein expression levels in cells of 3 groups of patients（±s，relative expression intensity）

表1 3組細(xì)胞的MST4蛋白表達(dá)水平比較（±s，相對表達(dá)強度）Tab 1 Comparison of MST4 protein expression levels in cells of 3 groups of patients（±s，relative expression intensity）

與高表達(dá)比較*P＜0.05

組別I L-6/（p g/m L）F P空白組 0.1 0 9±0.0 5 3* 5 1.3 9 2 0.0 0 0高表達(dá)組 0.7 7 8±0.1 8 0低表達(dá)組 0.1 1 7±0.0 5 9*

2.2 3組細(xì)胞的上清液中細(xì)胞因子水平比較 高表達(dá)組的上清液中 IL-6、IL-1β、TNF-α、CCL2 水平均顯著高于空白組和低表達(dá)組（P＜0.05）；空白組和低表達(dá)組的上清液中 IL-6、IL-1β、TNF-α、CCL2 水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表 2）。

表2 3組細(xì)胞的上清液中細(xì)胞因子水平比較（±s）Tab 2 Comparison of cytokine levels in the supernatant of three groups of cells（±s）

表2 3組細(xì)胞的上清液中細(xì)胞因子水平比較（±s）Tab 2 Comparison of cytokine levels in the supernatant of three groups of cells（±s）

與高表達(dá)比較*P＜0.05

組別 I L-6（p g/m L）I L-1 β（p g/m L）T N F-α（p g/m L）C C L 2（p g/m L）空白組 4 4.7±1 2.0* 4 1.6±1 1.3* 2 8.5±6.9* 3 8.3±1 1.2*高表達(dá)組 1 4 3.8±3 9.5 1 8 2.5±2 8.0 3 9 5.6±5 5.3 1 9 0.5±4 4.0低表達(dá)組 4 0.0±1 0.5* 3 6.8±9.3* 2 7.0±6.3* 3 7.0±9.8*F 3 1.6 9 2 4 4.5 2 8 9 6.4 1 7 5 2.0 0 4 P 0.0 0 0 0.0 0 0 0.0 0 0 0.0 0 0

2.2 3組細(xì)胞中的ERK、p-ERK蛋白表達(dá)情況 空白組、高表達(dá)組和低表達(dá)組的ERK蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；高表達(dá)組的p-ERK蛋白顯著高于空白組和低表達(dá)組（P＜0.05），空白組和低表達(dá)組的p-ERK蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表 3，圖 1）。

表3 3組細(xì)胞的中ERK、p-ERK蛋白表達(dá)情況（±s）Tab 3 Expression of medium ERK,P-ERK protein in three groups of cells（±s）

表3 3組細(xì)胞的中ERK、p-ERK蛋白表達(dá)情況（±s）Tab 3 Expression of medium ERK,P-ERK protein in three groups of cells（±s）

與高表達(dá)比較*P＜0.05

組別 E R K（相對表達(dá)強度） p-E R K（相對表達(dá)強度）空白組 0.8 3 1±0.1 1 7 0.2 6 9±0.1 0 5*高表達(dá)組 0.8 5 9±0.1 3 3 0.6 2 2±0.1 4 5低表達(dá)組 0.8 4 0±0.1 0 8 0.2 8 0±0.0 8 6*F 2.2 5 9 3 5.5 9 8 P 0.1 7 7 0.0 0 0

圖1 Western-blot法檢測結(jié)果Fig 1 Detection result Western-blot

2.3 3組細(xì)胞的MTT實驗檢測結(jié)果 高表達(dá)組的MTT實驗吸光度值高于空白組和低表達(dá)組（P＜0.05）；空白組和低表達(dá)組的MTT實驗吸光度值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表 4）。

表4 3組細(xì)胞的MTT實驗檢測結(jié)果（±s）Tab 4 Results of MTT assay in three groups of cells（±s）

表4 3組細(xì)胞的MTT實驗檢測結(jié)果（±s）Tab 4 Results of MTT assay in three groups of cells（±s）

與高表達(dá)比較*P＜0.05

組別 M H C C 9 7 H肝癌細(xì)胞（吸光度值） F P空白組 0.2 0 6±0.0 7 7* 2 5.8 2 6 0.0 0 0高表達(dá)組 0.3 7 5±0.0 8 3低表達(dá)組 0.2 1 4±0.0 6 9*

2.4 3組細(xì)胞的Transwell實驗檢測結(jié)果 高表達(dá)組的Transwell實驗MHCC97H肝癌細(xì)胞遷移數(shù)目高于空白組和低表達(dá)組（P＜0.05）；空白組和低表達(dá)組的Transwell實驗MHCC97H肝癌細(xì)胞遷移數(shù)目差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表 5）。

表5 3組細(xì)胞的Transwell實驗檢測結(jié)果（±s）Tab 5 Transwell test resules of three groups of cell（±s）

表5 3組細(xì)胞的Transwell實驗檢測結(jié)果（±s）Tab 5 Transwell test resules of three groups of cell（±s）

與高表達(dá)比較*P＜0.05

組別 M H C C 9 7 H肝癌細(xì)胞（細(xì)胞數(shù)） F P空白組 8 8.3±1 4.6* 3 5.1 7 4 0.0 0 0高表達(dá)組 3 0 8.6±4 7.2低表達(dá)組 9 2.0±1 8.6*

3 討論

肝癌是指起源于肝間葉組織和肝臟上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，肝癌患者早期臨床癥狀多隱匿，被診斷時已多為晚期并伴有乏力、消瘦、肝區(qū)疼痛及肝大等臨床癥狀，臨床治療困難[5-6]。此外，肝癌細(xì)胞極易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移、浸潤，這給肝癌的根治造成了嚴(yán)重障礙。因此，研究肝癌癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制并探尋靈敏、準(zhǔn)確抑制肝癌轉(zhuǎn)移的治療靶點及方法對改善和提高肝癌患者預(yù)后意義顯著。

MST4屬于機(jī)體的重要激酶，可參與細(xì)胞骨架的形態(tài)形成、重排、細(xì)胞分化及凋亡等多種細(xì)胞活動，可促進(jìn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及生長[7-8]。高表達(dá)組的MST4蛋白表達(dá)顯著高于空白組和低表達(dá)組；空白組和低表達(dá)組的MST4蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。文獻(xiàn)[9-10]提示前列腺及乳腺癌患者腫瘤的惡性程度及侵襲性與MST4的高表達(dá)具有高度相關(guān)性，這也與本研究結(jié)果一致。

研究[11-12]證實腫瘤的轉(zhuǎn)移及侵襲過程與炎癥因子具有密切聯(lián)系，炎癥因子可激活腫瘤細(xì)胞及炎癥細(xì)胞，對抑制免疫介導(dǎo)的腫瘤監(jiān)視作用顯著。IL-6、IL-1β、TNF-α、CCL2 均為重要的促癌炎癥因子，認(rèn)為上述炎癥因子的分泌失調(diào)可促進(jìn)肝癌的早期發(fā)生及進(jìn)展[13]。本研究結(jié)果顯示，高表達(dá)組的上清液中IL-6、IL-1β、TNF-α、CCL2 水平均顯著高于空白組和低表達(dá)組；而空白組和低表達(dá)組的上清液中IL-6、IL-1β、TNF-α、CCL2水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。上述結(jié)果提示，肝癌細(xì)胞存在較高的炎癥因子水平，可能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲。動物實驗[14]證實，肝癌模型小鼠機(jī)體IL-1β及TNF-α表達(dá)水平明顯升高，這也與本研究結(jié)果相符。炎癥因子由免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞產(chǎn)生和分泌，具有免疫調(diào)節(jié)作用，參與細(xì)胞生長、分化、修復(fù)和免疫過程。而慢性病大多為炎癥因子參與的病理生理過程，腫瘤的發(fā)生均是由于一個長期的慢性炎癥刺激而導(dǎo)致的。故而，MST4可能是通過調(diào)控IL-6、IL-1β、TNF-α、CCL2等炎癥因子的分泌而影響腫瘤組織的病理發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示，空白組、高表達(dá)組和低表達(dá)組的ERK蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義；高表達(dá)組的p-ERK蛋白顯著高于空白組和低表達(dá)組；空白組和低表達(dá)組的p-ERK蛋白差異無統(tǒng)計學(xué)意義。上述結(jié)果提示，MHCC97H肝癌細(xì)胞中MST4高表達(dá)，將會激活p-ERK蛋白表達(dá)，從而提高細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲。MST4可通過MAPK通路的激活誘導(dǎo)EMT肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化，對肝癌的預(yù)后不良具有顯著的提示作用。ERK屬于MAPK家族最重要的蛋白激酶，其磷酸化后形成p-ERK才能成為具有活性的蛋白激酶，進(jìn)而調(diào)節(jié)包括細(xì)胞分化、增殖、衰老及凋亡等多種細(xì)胞調(diào)節(jié)作用，并調(diào)節(jié)炎癥因子的分泌及產(chǎn)生[15]。

增殖及侵襲實驗結(jié)果顯示，高表達(dá)組的MTT實驗吸光度值、Transwell實驗MHCC97H肝癌細(xì)胞遷移數(shù)目高于空白組和低表達(dá)組；空白組和低表達(dá)組的MTT實驗吸光度值、Transwell實驗MHCC97H肝癌細(xì)胞遷移數(shù)目差異無統(tǒng)計學(xué)意義。上述結(jié)果證實MHCC97H肝癌細(xì)胞中MST4高表達(dá)與癌細(xì)胞的遷移具有密切聯(lián)系，與上述研究結(jié)果一致。

綜上所述，MHCC97H肝癌細(xì)胞中MST4高表達(dá)，將會激活p-ERK蛋白表達(dá)，從而提高細(xì)胞因子的表達(dá)，提高M(jìn)HCC97H肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。