顧毅 劉周 徐方明 盛男 趙亞運(yùn) 孫凱莉 劉艷艷 葉英 李家斌

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染病科，安徽省細(xì)菌耐藥監(jiān)測中心，合肥 230023)

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,KP)屬于腸桿菌科克雷伯菌屬、為革蘭陰性菌，是臨床重要的條件致病菌，可感染人體全身尤其是呼吸和泌尿系統(tǒng)，引發(fā)肺炎、腦膜炎、肝膿腫和敗血癥等疾病。隨著抗生素的不恰當(dāng)使用，其耐藥率逐年上升。其中耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiella pneumoniae,CRKP)在全球廣泛分布并呈不斷增加的態(tài)勢[1]。CRKP常攜帶大量耐藥基因，對臨床常用的抗菌藥物呈現(xiàn)多重耐藥，僅對多黏菌素、替加環(huán)素敏感率較高[2]。研究表明，對替加環(huán)素耐藥的CRKP及攜帶mcr-1基因?qū)Χ囵ぞ啬退嶤RKP已經(jīng)出現(xiàn)，給臨床治療帶來了巨大挑戰(zhàn)[3-6]。在自然界，超過90%的細(xì)菌均以生物被膜(biofilm,BF)的形式存在，當(dāng)細(xì)菌BF形成后，其耐藥性相比于浮游菌會(huì)提高10～1000倍[7]，這使耐藥菌的被清除率進(jìn)一步降低，人體一旦被耐藥菌感染便成為一件岌岌可危的事情。因此，尋找能有效抑制細(xì)菌及其BF形成的新型抗菌藥物已成為防治KP的重要研究內(nèi)容。慶大霉素(gentamicin,GEN)作為治療KP導(dǎo)致的感染性疾病的常用抗菌藥物，近年來已有文獻(xiàn)報(bào)道，GEN對銅綠假單胞菌、葡萄球菌等病原微生物的BF形成有著抑制作用[8-10]。鎵作為一種半金屬元素，臨床上主要用于腫瘤的顯像檢查和治療[11-12]，近年來其抑菌作用被研究人員關(guān)注。相關(guān)研究表明，硝酸鎵(gallium nitrate,GaN)對鮑曼不動(dòng)桿菌、大腸埃希菌的生長及生物膜形成有較好的抑制或清除作用[13-14]。本實(shí)驗(yàn)以GEN為對照組，研究GaN對CRKP生長及其生物膜形成的影響，為有效治療耐藥菌引起的感染提供有效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

本研究的82株CRKP均分離于安徽省細(xì)菌耐藥監(jiān)測中心監(jiān)測網(wǎng)所屬34家醫(yī)院2015—2016年度的住院和門診患者的各類臨床標(biāo)本。其中來源于痰標(biāo)本63株，尿液標(biāo)本11株，血液標(biāo)本7株，分泌物標(biāo)本1株。標(biāo)準(zhǔn)菌株肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706為質(zhì)控菌株(保存于安徽省細(xì)菌耐藥監(jiān)控中心)。

1.1.2 儀器與試劑

VITEK-2 Compact細(xì)菌鑒定儀及配套GN鑒定卡(法國Biomerieux公司)；ZEISS LSM 510 META型激光共聚焦掃描顯微鏡(德國Chua公司)；硝酸鎵(美國Sigma公司)；M9CA肉湯培養(yǎng)基、結(jié)晶紫染色液(北京陸橋股份有限公司)；96孔、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國Corning公司)；細(xì)胞爬片(無錫耐思生物科技有限公司)；細(xì)菌培養(yǎng)電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏公司)；電子天平(上海名橋精密科學(xué)儀器公司)、移液器(德國Eppendorf公司)?？咕幬飿?biāo)準(zhǔn)品：亞胺培南(imipenem,IPM)、美羅培南(meropenem,MEM)、氨曲南(aztreonam,AZM)等均購自于中國食品藥品檢定研究院。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定與藥敏試驗(yàn)

所有菌株應(yīng)用VITEK-2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。所檢測的抗菌藥物包括氨芐西林、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/三唑巴坦、頭孢吡肟、頭孢曲松、頭孢西丁、頭孢他啶、頭孢唑肟、氨曲南、亞胺培南、美羅培南、阿米卡星、慶大霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、加替沙星及氯霉素應(yīng)用瓊脂倍比稀釋法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

1.2.2 GaN對CRKP的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentrations,MIC)測定

應(yīng)用微量肉湯稀釋法檢測：GaN對CRKP的MIC值，具體步驟如下：各實(shí)驗(yàn)菌接種于瓊脂平板上，37℃過夜，取單個(gè)菌落置生理鹽水配制約1×108～2×108CFU/mL。GaN用M9培養(yǎng)基配制成濃度為16μmol/mL溶液，過濾除菌，加入到無菌的96孔板內(nèi)，每排第1孔加260μL，第2～10孔每孔分別加入130μL培養(yǎng)基，然后從第一個(gè)孔移出130μL到第二個(gè)孔，以此類推成倍比稀釋，每株菌設(shè)4個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)無菌液的培養(yǎng)基為陰性對照和不含藥液的菌液為陽性對照。將培養(yǎng)板置于37℃培養(yǎng)24h，以實(shí)驗(yàn)孔中無細(xì)菌生長的最低藥物濃度為MIC，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取重復(fù)次數(shù)最多的值。

1.2.3 BF強(qiáng)陽性篩選

采用結(jié)晶紫染色法[15]。用瓊脂培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)待測菌株，菌液稀釋為2×108CFU/mL，按1:100取菌液轉(zhuǎn)移至96孔板中的130μL M9培養(yǎng)基中，將82株CRKP放于37℃培養(yǎng)箱靜置24h，吸取菌液，用無菌PBS清洗游離細(xì)菌，待完全干燥，每孔加入0.2%結(jié)晶紫染色液140μL，染色30min，用緩慢持續(xù)的流水將多余的染料沖洗干凈，待完全干燥后每孔加入95%乙醇150μL，使其與生物膜結(jié)合的結(jié)晶紫完全溶解，用酶標(biāo)儀檢測吸光度值(A570)，基于臨界值A(chǔ)c，菌株BF可分為弱(Ac4Ac)[15]。每個(gè)菌株設(shè)4個(gè)復(fù)孔，結(jié)果取平均值。以單純M9培養(yǎng)基為陰性對照。

1.2.4 BF抑制檢測

根據(jù)生物膜篩選及其相應(yīng)的MIC結(jié)果，選擇1/2MIC的GaN作用于強(qiáng)陽性BF菌株。按“1.2.3”項(xiàng)的方法，檢測31株BF強(qiáng)陽性的CRKP在1/2MIC藥液濃度下生物膜形成情況。37℃靜置培養(yǎng)24h，然后染色，檢測A570吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次，結(jié)果取平均值。

1.2.5 GaN與GEN分別對CRKP生物膜抑制率的檢測

從31株BF強(qiáng)陽性的CRKP中隨機(jī)挑選出20株菌,應(yīng)用微量肉湯稀釋法檢測GEN對CRKP的MIC值。按“1.2.3”項(xiàng)的方法，檢測20株菌分別在1/2MIC的GaN及1/2MIC的GEN藥物濃度下生物膜形成情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次，結(jié)果取平均值。以不加藥物處理的含菌的M9培養(yǎng)基為陽性對照，以單純M9培養(yǎng)基為空白對照。生物膜抑制率=(1-處理組A570/對照組A570)×100%[14]。

1.2.6 激光共聚焦掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscope,CLSM)三維生物膜結(jié)構(gòu)成像

將12mm無菌細(xì)胞爬片放入標(biāo)準(zhǔn)24孔微量板中，使孔板中含菌液的培養(yǎng)基的GaN終濃度分別為0、1MIC和1/2MIC，37℃靜置培養(yǎng)24h。吸取菌液，3.7%的甲醛固定，無菌PBS清洗游離細(xì)菌3次，0.1%吖啶橙避光染色5min[13]，再用無菌蒸餾水清洗多余染料，自然干燥。利用CLSM Zeiss LSM880觀測BF形成情況。參數(shù)設(shè)置如下：吖啶橙激發(fā)光波長為488nm，發(fā)射光波長512～654nm，物鏡20倍。利用Zeiss ZEM 2012軟件包獲取共聚焦圖片，通過Imaris 7.0軟件制作三維重組的BF成像圖片。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

CRKP對抗菌藥物的耐藥率應(yīng)用WHONET 5.6 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，折點(diǎn)解讀參照CLSI 2016標(biāo)準(zhǔn)[16]，生物膜以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，±s)的形式表示，生物膜抑制率以百分比(%)的形式表示，SPSS 17.0軟件進(jìn)行兩獨(dú)立樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥敏結(jié)果

安徽地區(qū)82株臨床分離的CRKP對β-內(nèi)酰胺類抗生素(氨芐西林、頭孢曲松)和單環(huán)酰胺類藥物(氨曲南)的耐藥率均為100.0%，對頭霉素類藥物(頭孢西丁)和β-內(nèi)酰胺+酶抑制劑類藥物(頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/三唑巴坦)的耐藥率較高，分別為95.1%、96.3%和97.6%，對喹諾酮類藥物的耐藥率為82.9%～98.8%，僅對氨基糖苷類藥物中阿米卡星的耐藥率較低，為59.8%(表1)。

2.2 GaN對CRKP的MIC值測定

應(yīng)用微量肉湯稀釋法檢測GaN對82株CRKP的抑菌情況，其MIC值范圍為0.0625～2μmol/mL，其中MIC50和MIC90分別為0.25和0.5μmol/mL。菌株MIC值分布情況見圖1。

表1 17種抗菌藥物對82株實(shí)驗(yàn)菌的藥敏結(jié)果(%)Tab.1 Susceptibility results of 17 antibiotics for 82 isolates(%)

圖1 GaN對82 株CRKP的MIC值的分布情況Fig.1 The distribution of MIC of Gallium nitrate for 82 isolates

2.3 BF強(qiáng)陽性篩選及CRKP生物膜抑制檢測

通過檢測，82株CRKP中BF強(qiáng)陽性(>4Ac)的CRKP為31株(37.8%)。1/2MICGaN對31株CRKP的BF作用結(jié)果，由SPSS 17.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示t=18.471，P<0.001，在α=0.05的檢驗(yàn)水準(zhǔn)下，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即1/2MIC GaN可以有效抑制CRKP的BF形成(表2)。

2.4 BF抑制率的檢測

通過檢測，GaN對實(shí)驗(yàn)菌株的BF抑制率為37.8%～60.9%，GEN對實(shí)驗(yàn)菌株的BF抑制率為32.4%～53.3%。兩組BF抑制率結(jié)果，由SPSS 17.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示t=3.639，P<0.05，在α=0.05的檢驗(yàn)水準(zhǔn)下，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即GaN和GEN對實(shí)驗(yàn)菌株的BF形成的作用有差別，且GaN的作用優(yōu)于GEN(圖2)。

2.5 BF三維結(jié)構(gòu)成像圖分析

用CLSM觀察CRKP在不同GaN濃度下BF三維結(jié)構(gòu)并測量其厚度，由圖顯示：沒有加入GaN的菌株形成了緊湊密集且厚的BF(A)，平均厚度為(250±0.7)nm；加入1/2MIC的GaN形成的BF較為稀疏，為散在的小斑塊(B)，平均厚度為(90±0.4)nm；當(dāng)GaN達(dá)到MIC值時(shí)，BF形成更為稀少，為散在的小點(diǎn)(C)，平均厚度為(27±0.3)nm。由此顯示，GaN對CRKP的BF形成有著良好的抑制作用(圖3)。

3 討論

細(xì)菌BF是多個(gè)細(xì)菌不可逆的黏附于機(jī)體或物體表面，被自身細(xì)胞分泌的基質(zhì)包被而形成的細(xì)菌聚集膜樣物[17]。肺炎克雷伯菌有著豐富的莢膜，并依靠莢膜多糖和細(xì)菌分泌的黏附分子及胞外DNA極易在物體表面形成BF結(jié)構(gòu)[18]。BF一旦形成，膜內(nèi)細(xì)菌可被不斷釋放，造成感染的遷延不愈與反復(fù)發(fā)作[7]。BF不僅可形成屏障來降低抗菌藥物的滲透能力，而且膜內(nèi)細(xì)菌由于營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏，代謝水平下降，對抗菌藥物的敏感性也隨之降低[19]。因此，積極尋找有效抑制BF形成的新型抗菌藥顯得尤為重要。

表2 GaN對31株菌的MIC值及BF的A570值(n=4,±s)Tab.2 MIC of gallium nitrate and biofilm A570 for 31 isolates (n=4,±s)

表2 GaN對31株菌的MIC值及BF的A570值(n=4,±s)Tab.2 MIC of gallium nitrate and biofilm A570 for 31 isolates (n=4,±s)

注：空白組代表用藥前BF的A570值；處理組代表用藥后BF的A570值；與空白組比較，“*”P<0.05

菌株 標(biāo)本來源MIC/(μmol/ mL) 空白組(A570) 處理組(A570)KP2445 痰液 0.5 0.583±0.124 0.228±0.04*KP0207 血液 0.125 0.579±0.172 0.272±0.074*KP1294 痰液 0.25 0.638±0.207 0.276±0.112*KP1035 痰液 0.25 0.682±0.148 0.322±0.054*KP0978 尿液 0.25 0.710±0.071 0.345±0.046*KP0796 痰液 0.125 0.677±0.158 0.328±0.055*KP1529 痰液 0.0625 0.692±0.114 0.371±0.422*KP1664 尿液 0.25 0.565±0.082 0.402±0.031*KP0656 痰液 0.25 0.674±0.143 0.419±0.142*KP1494 痰液 0.25 0.693±0.094 0.376±0.032*KP1349 痰液 0.25 0.772±0.047 0.457±0.042*KP2373 痰液 0.125 0.773±0.103 0.307±0.080*KP1820 痰液 0.25 0.550±0.040 0.296±0.025*KP2554 痰液 0.25 0.615±0.080 0.400±0.027*KP2916 痰液 0.25 0.545±0.017 0.282±0.010*KP2103 尿液 0.25 0.680±0.04 0.307±0.013*KP2090 痰液 0.5 0.650±0.083 0.317±0.052*KP1288 血液 0.25 0.636±0.166 0.344±0.059*KP1814 痰液 0.125 0.655±0.095 0.343±0.044*KP2328 尿液 0.25 0.745±0.202 0.364±0.054*KP1779 尿液 0.25 0.693±0.197 0.269±0.075*KP1815 痰液 0.25 0.589±0.118 0.255±0.067*KP2664 痰液 0.5 0.732±0.054 0.366±0.027*KP1665 痰液 0.5 0.578±0.035 0.228±0.052*KP2828 痰液 0.25 0.521±0.052 0.350±0.025*KP1905 痰液 0.25 0.533±0.034 0.210±0.012*KP1011 痰液 0.25 0.577±0.043 0.269±0.046*KP1262 血液 0.25 0.740±0.179 0.279±0.075*KP2699 痰液 1 0.720±0.156 0.254±0.067*KP2691 血液 0.125 0.817±0.123 0.335±0.080*KP0971 痰液 0.25 0.754±0.144 0.332±0.077*

圖2 GaN與GEN對CRKP生物膜的抑制率(%)Fig.2 The effect of GaN and GEN on the biofilm formation of CRKP (%)

圖3 CLSM檢測GaN作用下的BF形成Fig.3 Three-dimensional reconstructions of CLSM images of biofilm formation

本研究中收集了安徽省地區(qū)34家醫(yī)院臨床分離的82株CRKP，均為多重耐藥菌，給臨床治療帶來了困難，需加以足夠的重視。本研究中，首先測定了GaN對實(shí)驗(yàn)菌株的MIC值。從分布來看，MIC值范圍為0.0625～2μmol/mL，其中MIC50、MIC90分別為0.25和0.5μmol/mL。為進(jìn)一步探索GaN對BF形成的抑制作用提供了前提條件。

細(xì)菌BF一旦形成就很難被清除，因此如何有效地抑制BF形成至關(guān)重要。本次研究中，臨床分離菌株為82株，BF強(qiáng)陽性菌株所約占37.8%(31/82)，由此可見CRKP的BF形成的嚴(yán)重性。Kaneko等[20]研究發(fā)現(xiàn)GaN對銅綠假單胞菌的生長及其BF形成有抑制作用，不僅可以殺滅浮游菌，而且對已經(jīng)形成BF的細(xì)菌也同樣有效。本研究中采用的培養(yǎng)基為低鐵培養(yǎng)基，在這種鐵營養(yǎng)缺乏的生存條件下，細(xì)菌自身會(huì)產(chǎn)生一種小分子量鐵螯合物，進(jìn)而從外界攝取必要的鐵元素以供自身需要。實(shí)驗(yàn)采用1/2MIC GaN作用于31株BF強(qiáng)陽性的CRKP菌株，處理前后BF形成數(shù)據(jù)結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明GaN對BF形成有較好的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)中，GaN對CRKP的BF抑制率與GEN對CRKP的BF抑制率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，GaN對生物膜的抑制率優(yōu)于GEN。CLSM三維結(jié)構(gòu)成像圖直觀顯示，BF在1/2MIC與1MIC GaN條件下形成的量有明顯的降低，進(jìn)一步證明了GaN對BF形成有著較好的抑制作用。

本研究中僅對GaN在體外的抗菌作用進(jìn)行了試驗(yàn)，并沒有檢測其在體內(nèi)的抗菌作用。但有文獻(xiàn)表明，GaN可以通過擾亂結(jié)核分枝桿菌的鐵代謝來發(fā)揮抑菌作用，并且在小鼠肺結(jié)核模型中抑制了細(xì)菌的生長[21]。同時(shí)也有文獻(xiàn)報(bào)道，給志愿者口服500mg鎵制劑，血清藥物濃度為1μg/mL(約為0.0039μmol/mL)，遠(yuǎn)達(dá)不到抑菌濃度[22]。這可能是由于胃腸道中不溶性鎵氫氧化物的形成，降低了鎵的生物利用度[23]。在進(jìn)一步的研究中，我們將使鎵與其有協(xié)同作用的抗菌藥物聯(lián)用，從而提高鎵在體內(nèi)的生物活性，提高其應(yīng)用于治療臨床耐藥菌感染的潛力。并且，GaN已通過美國食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)用于治療腫瘤性高鈣血癥，具有很低的組織毒性[18]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CRKP形成BF的能力具有普遍性及嚴(yán)重性，伴隨著其BF的形成，其耐藥性也普遍提高。新型抗菌劑GaN對CRKP的BF形成有著較好的抑制作用，此結(jié)果將為GaN用于臨床抗感染治療奠定基礎(chǔ)。由于GaN具有抗菌活性，其與生物材料結(jié)合，從源頭阻止或減少細(xì)菌在侵入性醫(yī)療器材上的黏附與定植，進(jìn)而防止或降低細(xì)菌對宿主的感染，不失為目前抗感染的有效之舉。