王 瑜，李立郎，柏啟雪，張 潔，楊 娟，楊小生

（1.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室，貴州貴陽550002； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州貴陽550025）

野木瓜（Stauntonia chinensis）屬薔薇科灌木叢植物，為中國特有果木之一，素有“百益之果”美稱，是貴州省遵義市正安縣特有水果[1]。野木瓜皮薄肉厚、風(fēng)味濃郁、品質(zhì)優(yōu)良，富含氨基酸、維生素、多糖[2]、總黃酮[3]和酶等，其中有機酸包括檸檬酸、齊墩果酸[4]等，酶包括過氧化氫酶、超氧化物歧化酶（SOD）[5]等。由于野木瓜鮮食品種存在糖酸比極低、果實堅硬等特點，不適宜直接食用，通常將其制成野木瓜果干、飲料[6]、果酒[7]、果醋[8]等，無附加值較高的產(chǎn)品。酵素[9]是一種酶類，是由生物體制造出的具有催化作用的活性大分子，可以催化完成各種生理生化反應(yīng)，人體的新陳代謝[10]、能量攝取、生長和繁衍等生命現(xiàn)象都離不開酵素[11]。傳統(tǒng)酵素是將果蔬通過自然發(fā)酵而得到，發(fā)酵過程中微生物種類不可控，得到的產(chǎn)品質(zhì)量也不穩(wěn)定，存在一定的食品安全隱患[11]。本研究為了開發(fā)野木瓜的利用途徑，提高產(chǎn)品附加值，得到質(zhì)量穩(wěn)定口感獨特的野木瓜酵素，對其工藝進行優(yōu)化，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計4因素3水平的響應(yīng)面實驗，并結(jié)合模糊數(shù)學(xué)綜合評判對野木瓜酵素進行感官評價[13]，以確定野木瓜酵素的最佳工藝條件，為野木瓜酵素產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論技術(shù)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

野木瓜，貴州遵義市正安縣貴州遵安農(nóng)旅科技發(fā)展有限公司提供；酵素發(fā)酵劑，貴州省中科院天然產(chǎn)物重點實驗室自制；白糖，水。

1.2 工藝流程

野木瓜?清洗去籽?切塊打漿?調(diào)配?接種發(fā)酵?過濾?調(diào)配?灌裝?巴氏殺菌?成品

1.3 試驗方法

1.3.1 基于模糊數(shù)學(xué)建立野木瓜酵素感官評價標準

評定小組由10名專業(yè)人員組成,設(shè)定對產(chǎn)品的滋味、氣味、組織形態(tài)、色澤4個因素進行感官評價,評價標準見表1，即X=(滋味、氣味、組織形態(tài)、色澤)。品評人員對每個因素的評價按好、一般、差3個等級進行評定,即 Y=(Y1，Y2，Y3)=(好，一般，差)。在計算評分時，Y1=9分，Y2=5分，Y3=2分。根據(jù)滋味、氣味、組織形態(tài)、色澤在野木瓜酵素感官評價中的作用,確定各質(zhì)量因素的權(quán)重,分別為滋味(0.40)、氣味(0.30)、組織形態(tài)(0.20)、色澤(0.10)，記為A=(a1，a2，a3，a4)=(0.40，0.30，0.20，0.10)，且a1+a2+a3+a4=1。根據(jù)感官指標，設(shè)定2個判定域：因素集,即感官評定指標集A=（a1滋味，a2氣味，a3組織形態(tài)，a4色澤）；判定集,即感官質(zhì)量評語集Y=(Y1，Y2，Y3)=(好，一般，差)。從A到Y(jié)的一個模糊映射R,設(shè)A上模糊集為 A=(a1，a2，a3，a4)，表示滋味、氣味、組織形態(tài)、色澤的加權(quán)數(shù)，則有感官綜合得分B=A×R，式中：B表示感官綜合評定結(jié)果，A表示加權(quán)數(shù)集，R表示評判矩陣。

表1 野木瓜酵素感官評分標準

1.3.2 野木瓜發(fā)酵工藝試驗單因素篩選

由10人組成評定小組，基于模糊數(shù)學(xué)感官評判標準對其進行感官評定，根據(jù)感官評分結(jié)果，確定適宜的正安野木瓜酵素發(fā)酵工藝參數(shù)包括：發(fā)酵溫度，發(fā)酵時間，料液比，發(fā)酵劑添加量。其中發(fā)酵溫度篩選范圍：20℃、22℃、25℃、28℃、30℃；發(fā)酵時間篩選范圍：5 d、7 d、9 d、11 d、13 d；料液比篩選范圍：1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5；發(fā)酵劑添加量篩選范圍：0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%。

1.3.3 野木瓜發(fā)酵工藝響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，以感官綜合評分為響應(yīng)值，以發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、料液比、發(fā)酵劑添加量4個因素為自變量，設(shè)計4因素3水平共29組實驗的響應(yīng)面分析實驗，優(yōu)化野木瓜酵素發(fā)酵的工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 野木瓜發(fā)酵工藝實驗單因素篩選結(jié)果（表2）

表2 野木瓜酵素發(fā)酵溫度單因素實驗篩選結(jié)果

由10人組成評定小組，基于模糊數(shù)學(xué)感官評判標準對其進行感官評定，根據(jù)感官評分結(jié)果，確定適宜的正安野木瓜酵素發(fā)酵溫度工藝參數(shù)，發(fā)酵溫度篩選范圍：20℃、22℃、25℃、28℃、30℃，由表2可知,將10人對20℃、22℃、25℃、28℃、30℃這5個溫度梯度下4個因素的評價結(jié)果寫成一個模糊綜合感官評價矩陣為：

在計算評分時，Y1=9分，Y2=5分，Y3=2分，則得出的感官綜合評分如下：

圖1 4個單因素結(jié)果

參照發(fā)酵溫度的評判方法評判發(fā)酵時間、料液比、發(fā)酵劑添加量，分別計算出發(fā)酵時間：B5=4.32、B7=4.98、B9=5.08、B11=7.54、B13=5.26；料液比：B1∶1=3.68、B1∶2=3.92、B1∶3=4.98、B1∶4=7.70、B1∶5=6.36；發(fā)酵劑添加量：B0.1%=6.76、B0.2%=6.86、B0.3%=5.98、B0.4%=8.60、B0.5%=3.64。4個單因素結(jié)果見圖1。

通過分析上述4個單因素的感官綜合得分趨勢圖，可知發(fā)酵溫度適宜范圍在28℃左右，發(fā)酵時間適宜范圍在11 d左右，料液比適宜范圍在1∶4左右，發(fā)酵劑添加量適宜范圍在0.3%左右。

2.2 野木瓜發(fā)酵工藝響應(yīng)面優(yōu)化實驗結(jié)果分析（表3）

由10人組成評定小組，將以上29組實驗按照模糊數(shù)學(xué)感官綜合評判標準的評價結(jié)果寫成矩陣為：

表3 響應(yīng)面實驗感官評定結(jié)果

計算綜合感官評分時，Y1=9分，Y2=5分，Y3=2分，則依次類推算出的29組實驗的感官綜合評分結(jié)果見表4、表5。

通過表5數(shù)據(jù)可知，按照模糊數(shù)學(xué)感官綜合評判標準的評價結(jié)果為響應(yīng)值時，模型p＜0.01，表明二次方程模型極顯著。失擬項p=0.0616＞0.05，不顯著，說明回歸方程擬合度較高，數(shù)學(xué)模型穩(wěn)定，可用該數(shù)學(xué)模型對不同發(fā)酵條件下野木瓜酵素的感官綜合評分進行預(yù)測[14]。方程相關(guān)系數(shù)R2=0.8635，表明該模型反映86.35%的因變量與自變量的關(guān)系，根據(jù)F值，判斷各因素對野木瓜酵素的感官綜合評分的影響大小依次為料液比＞發(fā)酵劑添加量＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間，料液比對野木瓜酵素的感官綜合評分的影響最顯著。

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對應(yīng)于實驗因素A、B、C和D所構(gòu)成的三維空間的曲面圖及其在二維平面上的等高線圖,其可以直觀地反映各因素及它們之間的交互作用對響應(yīng)值的影響。響應(yīng)面圖的曲面坡度越大，則因素的改變對于響應(yīng)值的影響越顯著，表明兩因素交互作用對響應(yīng)值的影響越大，反之，響應(yīng)面圖曲面越平緩，則因素對于響應(yīng)值的影響不顯著，兩因素交互作用對響應(yīng)值的影響較小。等高線直觀地反映出兩個因素之間交互作用的顯著程度，其中橢圓越扁平或橢圓的軸線與坐標軸之間角度越大，則表明兩因素交互作用越顯著，反之，則不顯著[15]。各因素之間的交互作用結(jié)果見圖2—圖7。

表4 野木瓜酵素響應(yīng)面實驗方案及結(jié)果

由圖2—圖7可知，發(fā)酵溫度與發(fā)酵時間交互作用顯著，發(fā)酵溫度與發(fā)酵劑添加量交互作用顯著，發(fā)酵劑添加量與發(fā)酵時間交互作用顯著，其余3組間交互作用不顯著，與方差分析結(jié)果一致。

2.3 響應(yīng)面擬合方程的建立

采用Design-Expert8.0程序?qū)Ρ?中所得數(shù)據(jù)進行回歸分析,各因素經(jīng)過回歸擬合后,解得回歸方程：利用Design expert軟件對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到野木瓜酵素感官評分為響應(yīng)值(Y)對發(fā)酵時間(A)、發(fā)酵劑添加量(B)、發(fā)酵溫度(C)、料液比(D)的編碼后的二次多項回歸模型方程：Y=7.58-0.23*A-0.053*B-0.067*C+0.45*D+0.24*A*B-0.60*A*C-0.41*A*D +0.12*B*C-0.27*B*D-0.070*C*D-0.43*A2-0.61*B2-0.78*C2-0.014*D2。其相應(yīng)的實際因素方程為Y=-100.22+5.19×發(fā)酵時間+24.50×發(fā)酵劑添加量+5.37×發(fā)酵溫度+4.25×料液比+1.20×發(fā)酵時間×發(fā)酵劑添加量-0.10×發(fā)酵時間×發(fā)酵溫度-0.21×發(fā)酵時間×料液比+0.38×發(fā)酵劑添加量×發(fā)酵溫度-2.75×發(fā)酵劑添加量×料液比-0.02×發(fā)酵溫度×料液比-0.11×發(fā)酵時間2-61.37×發(fā)酵劑添加量2-0.09×發(fā)酵溫度2-0.01×料液比2。對回歸方程進行分析,得出野木瓜酵素發(fā)酵的最佳工藝條件為：發(fā)酵時間9 d，發(fā)酵劑添加量0.26%，發(fā)酵溫度25.78℃，料液比1∶5，其理論感官評分為8.42?？紤]到工藝條件的可操作性,將工藝參數(shù)修正為：發(fā)酵時間9 d，發(fā)酵劑添加量0.3%，發(fā)酵溫度25℃，料液比為1∶5，用以上最佳工藝條件進行3次重復(fù)實驗，其實際感官評分為8.34，與理論預(yù)測值基本吻合，說明得到的二次回歸方程與實際情況擬合較好。本工藝所得的野木瓜酵素口感獨特，活性成分較高。

表5 響應(yīng)面二次回歸模型方差分析表

圖2 發(fā)酵劑添加量與發(fā)酵時間交互作用對感官評分的影響

圖3 發(fā)酵溫度與發(fā)酵時間交互作用對感官評分的影響

圖4 料液比與發(fā)酵時間交互作用對感官評分的影響

圖5 發(fā)酵溫度與發(fā)酵劑添加量交互作用對感官評分的影響

圖6 料液比與發(fā)酵劑添加量交互作用對感官評分的影響

圖7 料液比與發(fā)酵溫度交互作用對感官評分的影響

3 結(jié)論

本研究在單因素實驗的基礎(chǔ)上設(shè)計4因素3水平的響應(yīng)面實驗，并結(jié)合模糊數(shù)學(xué)綜合評判對野木瓜酵素進行感官評價，建立了野木瓜酵素發(fā)酵工藝的多元二次回歸方程：Y=7.58-0.23*A-0.053*B-0.067*C+0.45*D+0.24*A*B-0.60*A*C-0.41*A*D+0.12*B*C-0.27*B*D-0.070*C*D-0.43*A2-0.61*B2-0.78*C2-0.014*D2；得出野木瓜酵素的最佳發(fā)酵工藝條件：發(fā)酵時間9 d，發(fā)酵劑添加量0.3%，發(fā)酵溫度25℃，料液比為1∶5，在此條件下發(fā)酵的野木瓜酵素感官評分為8.34，活性成分超氧化物歧化酶（SOD）含量較高，可以為野木瓜酵素產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論技術(shù)參數(shù)。