周龍 王立林 胡序懷

[摘要]目的 篩選出小鼠原代肝細(xì)胞中PTEN基因沉默所需的高效siRNA。方法 采用兩步膠原酶灌注法分離小鼠原代肝細(xì)胞，放入25 cm2膠原包被瓶中（1×106個/瓶），均分為5組：對照組（C組）、陰性對照組（NC組）、siR-996組、siR-1381組、siR-1519組。采用HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑將各組對應(yīng)的siRNA序列轉(zhuǎn)入小鼠原代肝細(xì)胞，24 h后提取RNA和蛋白，通過Real-time PCR檢測各組PTEN mRNA表達(dá)，通過Western blot檢測各組PTEN蛋白含量。結(jié)果 siR-996組、siR-1381組和siR-1519組的PTEN蛋白含量低于NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），siR-996組、siR-1381組和siR-1519組的PTEN mRNA水平低于NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。siR-996組的PTEN蛋白含量及PTEN mRNA水平最低，其PTEN蛋白含量及PTEN mRNA水平的沉默效率高于siR-1381組和siR-1519組。結(jié)論 siR-996是小鼠原代肝細(xì)胞中PTEN基因沉默所需的高效siRNA。

[關(guān)鍵詞]小鼠原代肝細(xì)胞;PTEN磷酸水解酶;小干擾RNA;胰島素抵抗

[中圖分類號] R332? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）3（b）-0022-04

胰島素抵抗是影響危重患者預(yù)后的重要因素[1-2]，丙泊酚在臨床上廣泛用于處于胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)患者的鎮(zhèn)靜和麻醉，但是丙泊酚對胰島素抵抗的影響及機(jī)制卻鮮有研究。本課題組先前研究發(fā)現(xiàn)[3]，丙泊酚可抑制小鼠原代肝細(xì)胞Akt/GSK-3β信號通路，引起小鼠原代肝細(xì)胞胰島素抵抗，但丙泊酚的作用靶點并不在GSK-3β，而是在其上游。PTEN是PI3K/Akt信號通路的重要調(diào)節(jié)基因[4-7]，處于GSK-3β上游，本課題組將選擇PTEN作為研究對象，試圖通過在基因水平對PTEN進(jìn)行干擾，揭示丙泊酚所致胰島素抵抗的分子機(jī)制。所以，篩選出PTEN基因沉默所需的高效siRNA是關(guān)鍵，吉瑪基因公司以PTEN為靶基因，設(shè)計合成了3條siRNA供選擇，本實驗將這些siRNA轉(zhuǎn)染小鼠原代肝細(xì)胞，篩選出沉默效率最高的siRNA，為后續(xù)基因沉默實驗合理選擇siRNA提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1材料

siRNA-996、siRNA-1381、siRNA-1519、陰性對照siRNA（吉瑪基因公司，上海），各組siRNA的序列見表1。細(xì)胞培養(yǎng)試劑（Invitrogen公司，美國），HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑盒（Qiagen公司，德國），SDS-PAGE試劑（Bio-Rad Laboratories公司，美國），兔抗PTEN抗體（Cell Signaling Technology公司，美國），聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore公司，美國），M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（Promega公司，美國），Trizol試劑盒（Invitrogen公司，美國）。雄性C57BL/6小鼠由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部提供[許可證號：SCXK（京）2016-0010]。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組? 采用兩步膠原酶灌注法分離小鼠原代肝細(xì)胞[8-9]，收集細(xì)胞于50 ml離心管中，800 r/min，8 min離心，棄上清液，用細(xì)胞培養(yǎng)基重新懸浮，顯微鏡下臺盼藍(lán)染色觀察活細(xì)胞，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，放入25 cm2膠原包被瓶中（1×106個/瓶）。這些細(xì)胞均分為5組：對照組（C組）;陰性對照組（NC組）：加入終濃度為50 nmol/L的陰性對照siRNA;siR-996組：加入終濃度為50 nmol/L的siR-996;siR-1381組：加入終濃度為50 nmol/L的siR-1381;siR-1519組：加入終濃度為50 nmol/L的siR-1519。

1.2.2 siRNA轉(zhuǎn)染? 按HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑盒說明書，在24孔板中每孔加入6×104個小鼠原代肝細(xì)胞，用含100 U/ml青霉素、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋至500 μl，置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中。用無血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋75 ng siRNA至終濃度為50 nmol/L，然后加入3 μl HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑，輕搖混勻，室溫下靜置10 min。將混合物逐滴加入培養(yǎng)皿中，混勻，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.3 PETN蛋白檢測? 先用RIPA裂解緩沖液提取各組細(xì)胞中的總蛋白，再用BCA法檢測蛋白含量。每組上樣30 μg總蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠行恒壓電泳，將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，加入1：1000稀釋的PTEN和β-actin一抗，4℃孵育過夜，加入1：3000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h，洗膜后采用ECL化學(xué)發(fā)光顯影，最后用Gel-Pro Analyzer分析蛋白條帶灰度值。

1.2.4 PTEN mRNA檢測? 按Trizol試劑盒的說明書提取細(xì)胞總的RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒的說明書操作。PTEN上游引物：3′-TGTATCGCGGAGACTGACCCTTAA-5′，PTEN下游引物：5′-GATTGCAAGTTCCGCCACTGAACA-3′。HPRT1上游引物：3′-TCGTTCTGCAAGTCAGGACAGGTATTAA-5′，HPRT1下游引物：5′-TCCAGCAGGTCAGCAAAGAATTTATAGC-3′。PCR的反應(yīng)條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)。PCR完畢后以HPRT1作為內(nèi)參基因，采用SDS軟件分析產(chǎn)物熔解曲線。

1.3觀察指標(biāo)及評價標(biāo)準(zhǔn)

比較NC組、siR-996組、siR-1381組、siR-1519組的PTEN蛋白含量及PTENmRNA水平。PTEN蛋白含量及PTENmRNA水平的沉默效率與各組的PTEN蛋白含量及PTENmRNA水平成反比，含量或水平越低，表明其沉默效率越高。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較用單因素方差分析;以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

siR-996組、siR-1381組和siR-1519組的PTEN蛋白含量低于NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），siR-996組、siR-1381組和siR-1519組的PTEN mRNA水平低于NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）（表2）。siR-996組的PTEN蛋白含量及PTEN mRNA水平最低，其PTEN蛋白含量及PTEN mRNA水平的沉默效率高于siR-1381組和siR-1519組。

3討論

胰島素抵抗是指正常劑量的胰島素所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)降低的一種現(xiàn)象，不僅存在于糖尿病，還可以存在于其它許多病理情況下，甚至于生理情況下[10-14]。胰島素抵抗是導(dǎo)致手術(shù)患者和危重患者發(fā)生應(yīng)激性高血糖的重要機(jī)制之一[1-2]。丙泊酚是當(dāng)前臨床上最常用的靜脈麻醉劑，被廣泛用于手術(shù)患者的麻醉，而且還常用于危重患者的鎮(zhèn)靜。在當(dāng)前臨床實踐中丙泊酚常用于處在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)的危重患者，但是丙泊酚對胰島素抵抗的影響或機(jī)制卻少有研究。先前研究表明[15]，丙泊酚可引起大鼠全身性胰島素抵抗，但具體的分子機(jī)制尚不清楚。本課題組研究發(fā)現(xiàn)[3]，丙泊酚能抑制小鼠原代肝細(xì)胞Akt/GSK-3β信號通路，從而抑制糖原合成，同時還發(fā)現(xiàn)丙泊酚的作用靶點并不在GSK-3β，而是在GSK-3β的上游。PTEN處于GSK-3β的上游，是PI3K/Akt/GSK-3β信號通路的重要調(diào)節(jié)基因[4-7]，因此在后續(xù)研究中課題組將PTEN列為觀察對象，試圖通過在基因水平對PTEN進(jìn)行干擾，探究丙泊酚對小鼠原代肝細(xì)胞PTEN表達(dá)的影響。所以，篩選出PTEN基因沉默所需的高效siRNA是當(dāng)前研究的關(guān)鍵。吉瑪基因公司以PTEN為靶基因，設(shè)計合成了3條siRNA供選擇：siR-996、siR-1381和siR-1519。本實驗采用siR-996、siR-1381和siR-1519轉(zhuǎn)染小鼠原代肝細(xì)胞，評價3種siRNA各自的沉默效率，旨在篩選出沉默效率最高、效果滿意的的siRNA，為后續(xù)PTEN基因沉默實驗選擇較為理想的siRNA。

PTEN是第一個被人類發(fā)現(xiàn)的具有磷酸酶活性的抑癌基因[16-17]，PTEN編碼的蛋白在細(xì)胞漿中表現(xiàn)出雙重特異性磷酸酶活性，在細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡過程中起重要作用。PTEN蛋白募集到細(xì)胞膜上，發(fā)揮脂質(zhì)磷酸酶作用，使多種蛋白質(zhì)磷酸化，從而影響多條信號傳導(dǎo)通路，最終對基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控。PTEN被認(rèn)為是PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要調(diào)節(jié)基因，PTEN結(jié)合到質(zhì)膜后可催化抑制PIP3生成的反應(yīng)，從而調(diào)控PI3K/Akt信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)[4-7]。

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是生物體內(nèi)特定基因表達(dá)受到抑制的一種現(xiàn)象。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入雙鏈RNA或短發(fā)夾RNA時，與之互補(bǔ)的內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)將裂解，從而導(dǎo)致基因沉默[18]。雙鏈RNA經(jīng)外界進(jìn)入細(xì)胞，被Dicer酶識別而被加工成21-25nt的雙鏈RNA，這些短雙鏈RNA在沉默通道中發(fā)揮主要作用，是特定mRNA被降解的主要因素，被稱為小干擾RNA（siRNA）。與目標(biāo)mRNA互補(bǔ)的siRNA可介導(dǎo)沉默復(fù)合體，特異性地降解與之高度互補(bǔ)的靶mRNA，從而抑制靶基因表達(dá)[19-20]。HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑是一種中性脂和陽離子組成的混合物，可有效攝入siRNA并釋放細(xì)胞內(nèi)的siRNA，基因敲除效率較高。設(shè)立對照是評估RNAi實驗可信度的重要因素，本研究設(shè)立陰性對照主要是用來評估RNA干擾的特異性。本研究結(jié)果提示，siR-996組、siR-1381組和siR-1519組的PTEN蛋白含量低于NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），siR-996組、siR-1381組和siR-1519組的PTEN mRNA水平低于NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。siR-996組的PTEN蛋白含量及PTEN mRNA水平最低，其PTEN蛋白含量及PTEN mRNA水平的沉默效率高于siR-1381組和siR-1519組。提示基因公司提供的3種siRNA都可不同程度地抑制PTEN表達(dá)，但以siR-996抑制程度最深、效果最滿意，與NC組比較，其PTEN蛋白表達(dá)和PTEN mRNA表達(dá)均下降較多。

綜上所述，本研究以PTEN為靶基因，觀察比較了3種不同siRNA的沉默效率，其中siR-996的沉默效率最高，是PTEN基因沉默實驗較為理想的選擇。

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（收稿日期：2018-09-25? 本文編輯：孟慶卿）