戚登斐，張潤光，韓海濤，楊 濤，張有林

(陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院，西安 710119)

核桃仁中油脂含量高達60%～70%。核桃油中亞油酸、亞麻酸及油酸等不飽和脂肪酸含量高達90%，具有很高的營養(yǎng)及藥用價值[1-3]。亞油酸作為一種不飽和脂肪酸，是人體不能合成或合成量遠不能滿足需要的必需脂肪酸，其參考攝入量最低占攝入總能量的2.5%。亞油酸能有效降低人體血液膽固醇含量[4]，提高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量[5]，阻礙脂質(zhì)在血管壁上累加沉積，預防動脈粥樣硬化，使得血管壁功能得到完善和提高[6-8]。

與超臨界萃取法[9]、色譜分離法[10]、分子蒸餾法[11]、精餾分離法[12-13]等分離純化不飽和脂肪酸的方法相比，尿素包合法具有設(shè)備簡單、節(jié)約成本、工藝流程簡化、高溫下能停止反應(yīng)等優(yōu)點，且形成尿素包合物后，不飽和脂肪酸雙鍵由于包合物的保護而不易發(fā)生氧化，使其生理活性良好且適合大規(guī)模分離、富集各種不飽和脂肪酸[14]。本文通過單因素試驗初步優(yōu)化了尿素包合法提取分離亞油酸的工藝，同時以昆明小鼠為研究對象，探討核桃油中亞油酸降血脂功能，以期為研制降血脂功能性食品和核桃油不飽和脂肪酸功能評價提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

核桃：香玲品種，西安市核桃良種資源圃提供，經(jīng)冷榨，制備核桃油；花生油：魯花5S壓榨一級油(非轉(zhuǎn)基因)，市場購買；亞油酸：本實驗室自制，純度99.5%；昆明小鼠：雄性，體重(22.0 g±2.0 g)，西安市第四軍醫(yī)大學試驗動物中心提供；基礎(chǔ)飼料：西安市第四軍醫(yī)大學試驗動物中心提供(亞油酸含量≤0.5%)；高脂飼料：用85%基礎(chǔ)飼料、2%膽固醇、12.5%豬油、0.5%膽酸鈉配制而成；尿素、乙醇、無水硫酸鈉、石油醚、丙酮、硫酸、甲醇、鹽酸、氫氧化鉀：分析純；異辛烷：色譜純；混合脂肪酸甲酯標準品(純度>99.6%)：購于美國Sigma公司；甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、總膽固醇(TC)等測定試劑盒：購于上海榮盛生物技術(shù)有限公司。

PHS-3C 精密pH計，TDL80-2B離心沉淀機，TRACE 2000型氣相色譜儀(美國熱電公司)，JB-3定時恒溫磁力攪拌器，RE-52旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器。

1.2 試驗方法

1.2.1 核桃油中脂肪酸混合液的制備

參考Gu等[15]的方法。稱取50 g核桃油并與200 mL 4%的KOH-95%乙醇溶液混合置于燒瓶中，升溫至75℃，皂化回流2 h，加入溫水，攪拌30 min使皂化物充分溶解。調(diào)節(jié)pH至2，恒溫攪拌15 min，在分液漏斗中分離出油層，加適量石油醚溶解，溫水洗滌至中性。加入一定量無水Na2SO4脫水，過濾，于40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去有機溶劑，制得核桃油中脂肪酸混合液并稱重。

1.2.2 尿素包合法

參考Gu等[15]的方法。將95%乙醇與尿素按比例加入燒瓶中，升溫至65℃攪拌，待尿素全部溶解，向其中加入制備好的脂肪酸混合液，水浴回流40 min，冷卻至室溫后迅速轉(zhuǎn)入低溫。一段時間后取出迅速減壓抽濾得到濾液和尿素結(jié)晶物，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去濾液中乙醇，將濾液剩余物溶解于40℃溫水中并調(diào)節(jié)pH至2，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入適量石油醚，后水洗至中性，加入無水Na2SO4干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，即可得到尿素包合后的多不飽和脂肪酸，稱重，按下式計算脂肪酸得率。

脂肪酸得率=純化后脂肪酸的質(zhì)量/純化前混合脂肪酸的質(zhì)量×100%

1.2.3 亞油酸純度測定

甲酯化：在燒瓶中稱取0.1 g脂肪酸樣品，70℃水浴鍋中甲酯化30 min，同時加入2 mL 1%硫酸-甲醇溶液。后加入2 mL異辛烷，加入蒸餾水至瓶頸口，靜置分層，選取異辛烷層進行氣相色譜分析。

氣相色譜條件：HP-INNOWAX石英毛細管色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；采取程序升溫模式，起始溫度140℃并保持5 min，后以4℃/min 升溫至 220℃，保持15 min；進樣口溫度260℃，檢測器溫度280℃；氮氣為載氣，流速1.0 mL/min；分流比20∶1，進樣量1 μL；FID檢測器。

采用面積歸一化法計算亞油酸的純度。

1.2.4 亞油酸降血脂試驗

1.2.4.1 試驗設(shè)計

選取健康雄性昆明小鼠110只，基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，隨機分為11個小組(見表1)，空白對照組G1飼喂基礎(chǔ)飼料，其他各組均飼以高脂飼料，其中G2組小鼠灌胃高脂飼料，為高脂模型組，G3～G11組每天上午9點分別按表1灌胃不同劑量的核桃油、花生油及亞油酸。各組小鼠自由飲水，自然光照，飼喂4周。

表1 試驗動物劑量設(shè)計及分組

注:表中選用劑量參考小鼠最適宜油脂攝入量。

1.2.4.2 小鼠血脂測定及動脈硬化指數(shù)計算

4周后，小鼠均禁食12 h后摘除眼球，眼眶采血， 3 000 r/min離心5 min，分離得到血清，用試劑盒法當天測定TG、TC、HDL-C、LDL-C含量，按下式計算動脈硬化指數(shù)(AI)。

1.2.4.3 小鼠肝臟系數(shù)的測定

小鼠按上述方法取血后，隨即引頸處死，立即取出肝臟，用生理鹽水洗凈，濾紙吸去多余水分，稱重，按下式計算肝臟系數(shù)。

肝臟系數(shù)=肝臟質(zhì)量/體重×100%

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理，結(jié)果均以“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 尿素包合法分離純化亞油酸條件優(yōu)化

2.1.1 最佳包合時間確定

在尿素包合溫度-10℃、95%乙醇與尿素體積質(zhì)量比值4、混合脂肪酸與尿素質(zhì)量比值0.4條件下，測定包合時間分別為6、12、18、24、30、36 h時亞油酸純度及產(chǎn)品得率，結(jié)果見圖1。

圖1 包合時間對亞油酸純度及產(chǎn)品得率的影響

由圖1看出，包合時間在6～24 h內(nèi)，亞油酸純度和產(chǎn)品得率隨包合時間延長而升高。包合24 h結(jié)晶過程大體完成，亞油酸純度最佳；之后亞油酸純度，產(chǎn)品得率變化不大。因此，以包合時間24 h為佳。

2.1.2 最佳包合溫度確定

在包合時間24 h、95%乙醇與尿素體積質(zhì)量比值4、混合脂肪酸與尿素質(zhì)量比值0.4條件下，測定包合溫度在-15、-10、-5、0、5、10℃時亞油酸純度及產(chǎn)品得率，結(jié)果見圖2。

圖2 包合溫度對亞油酸純度及產(chǎn)品得率的影響

由圖2看出，亞油酸純度隨包合溫度升高而降低，但產(chǎn)品得率提高。原因可能是體系溫度提高后因亞油酸氧化而對包合純度有影響。此外，在形成尿素包合物時體系放熱，反應(yīng)隨溫度降低朝正向進行，進而快速形成包合物晶體便于分離，但當溫度低于一定范圍，雖然濾液中的亞油酸純度提高，但一定程度影響了產(chǎn)品得率。因此，綜合考慮，較為理想的包合溫度為-5℃。

2.1.3 混合脂肪酸與尿素最佳質(zhì)量比值確定

在包合溫度-5℃、95%乙醇與尿素體積質(zhì)量比值4、包合時間24 h條件下，測定混合脂肪酸與尿素質(zhì)量比值分別為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7時亞油酸純度及產(chǎn)品得率，結(jié)果見圖3。

圖3 混合脂肪酸與尿素質(zhì)量比值對亞油酸純度和產(chǎn)品得率的影響

由圖3看出，亞油酸純度隨混合脂肪酸與尿素質(zhì)量比值的增加而降低，在混合脂肪酸與尿素質(zhì)量比值小于0.3時，產(chǎn)品得率隨混合脂肪酸與尿素質(zhì)量比值的增加而提高，之后產(chǎn)品得率基本恒定。原因可能是脂肪酸混合液中的單不飽和脂肪酸能在分子結(jié)晶時與尿素結(jié)合并析出穩(wěn)定的晶體包合物，而混合液中的多不飽和脂肪酸由于其結(jié)構(gòu)難以被尿素包合。反應(yīng)時尿素量較少會降低包合程度，使包合不充分，隨著體系中尿素含量的增加，包合越充分，使產(chǎn)品得率降低。綜合考慮，以混合脂肪酸與尿素質(zhì)量比值0.3為佳。

2.1.4 95%乙醇與尿素最佳體積質(zhì)量比值確定

在包合溫度-5℃、混合脂肪酸與尿素質(zhì)量比值0.3、包合時間24 h條件下，測定95%乙醇與尿素體積質(zhì)量比值分別為2、3、4、5、6、7時亞油酸純度及產(chǎn)品得率，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，亞油酸的純度和產(chǎn)品得率均隨95%乙醇與尿素體積質(zhì)量比值增加而緩慢提高。其原因可能是伴隨溶劑量加大，脂肪酸溶解度也在逐漸增大，從而產(chǎn)品得率得以提高，也增強了尿素對核桃油中飽和脂肪酸及單不飽和脂肪酸的結(jié)合能力，亞油酸純度得以提高。綜合可知，尿素包合時95%乙醇與尿素體積質(zhì)量比值為5時最佳。

圖4 95%乙醇與尿素體積質(zhì)量比值對亞油酸純度和產(chǎn)品得率的影響

2.2 尿素包合亞油酸純度及脂肪酸的組成

由單因素試驗確定尿素包合法分離純化亞油酸最佳工藝條件為：包合溫度-5℃，包合時間24 h，95%乙醇與尿素體積質(zhì)量比值5，混合脂肪酸與尿素質(zhì)量比值0.3。在最佳工藝條件下進行3次平行驗證試驗，得到亞油酸的氣相色譜圖見圖5，亞油酸的平均純度為80.21%，說明優(yōu)化得到的提取條件可靠。

圖5 核桃油尿素包合純化后脂肪酸氣相色譜圖

2.3 核桃油中亞油酸功能評價

2.3.1 對小鼠體重的影響(見圖6)

圖6 不同劑量花生油、核桃油、亞油酸對小鼠體重影響

由圖6看出，隨飼喂時間的延長，空白對照組與高脂模型組小鼠體重的變化趨勢基本相同。在給小鼠連續(xù)灌胃28 d不同劑量的花生油、核桃油、亞油酸之后，小鼠體重雖高于空白對照組，但低于高脂模型組?；ㄉ徒M與核桃油組小鼠的體重均隨劑量的增加而增加。在亞油酸組中，隨劑量增加，小鼠體重呈直線下降趨勢。由此可見，亞油酸對于降低高脂小鼠體重作用明顯。

2.3.2 對小鼠肝臟的影響(見圖7)

圖7 不同劑量花生油、核桃油、亞油酸對小鼠肝重與肝臟系數(shù)的影響

由圖7看出，在給小鼠連續(xù)灌胃28 d不同劑量花生油、核桃油、亞油酸之后，小鼠肝重和肝臟系數(shù)雖然高于空白對照組，但低于高脂模型組?；ㄉ徒M與核桃油組小鼠的肝重和肝臟系數(shù)均隨灌胃劑量的增加而增加。亞油酸組中，隨灌胃劑量增加，小鼠的肝重和肝臟系數(shù)呈直線下降趨勢。由此可知，亞油酸能明顯降低高脂小鼠肝重與肝臟系數(shù)。

2.3.3 對小鼠血脂的影響

2.3.3.1 對血清中TG及TC水平的影響(見圖8)

圖8 不同劑量花生油、核桃油、亞油酸對小鼠TC與TG水平的影響

由圖8看出，高脂模型組相比于空白對照組，小鼠血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)水平均有明顯升高，表示小鼠高脂血癥模型構(gòu)建成功。給建模后小鼠連續(xù)灌胃28 d不同劑量的花生油、核桃油、亞油酸，小鼠血清TC、TG水平明顯低于高脂模型組?；ㄉ徒M與核桃油組小鼠血清TC、TG水平均隨灌胃劑量的增加而下降。亞油酸組小鼠血清TC、TG水平隨灌胃劑量的增加呈下降趨勢。由此可知，亞油酸降低高脂小鼠血清TC、TG水平能力更優(yōu)。

2.3.3.2 對血清HDL-C和LDL-C水平的影響(見圖9)

由圖9看出，小鼠灌胃28 d，與空白對照組相比，高脂模型組小鼠HDL-C、LDL-C水平發(fā)生了明顯的變化，建模成功。給小鼠連續(xù)灌胃28 d不同劑量的花生油、核桃油、亞油酸之后，小鼠血清HDL-C 水平明顯高于高脂模型組， LDL-C水平明顯低于高脂模型組?；ㄉ徒M與核桃油組小鼠血清HDL-C水平隨灌胃劑量的增加而明顯升高， LDL-C隨灌胃劑量的增加而明顯降低。亞油酸組中，隨灌胃劑量的增加，HDL-C呈直線上升趨勢， LDL-C呈直線下降趨勢。

圖9 不同劑量花生油、核桃油、亞油酸對HDL-C與LDL-C水平影響

2.3.3.3 對動脈硬化指數(shù)的影響(見圖10)

圖10 不同劑量花生油、核桃油、亞油酸對AI的影響

由圖10看出，小鼠灌胃28 d，高脂模型組小鼠的動脈硬化指數(shù)(AI)明顯高于空白對照組，說明高脂模型組小鼠患高脂血癥概率增加。與高脂模型組相比，在給小鼠連續(xù)灌胃28 d不同劑量的花生油、核桃油、亞油酸之后，小鼠的AI明顯下降，說明花生油、核桃油、亞油酸均有降低小鼠患高脂血癥的作用?；ㄉ徒M與核桃油組小鼠的AI隨灌胃劑量的增加而下降。亞油酸組中，隨灌胃劑量的增加小鼠的AI明顯下降。由此可知，亞油酸降低高脂小鼠的AI作用更優(yōu)。

3 結(jié) 論

本試驗以冷榨核桃油為原料，通過單因素試驗初步確定尿素包合法分離純化亞油酸的最佳工藝條件為：包合時間24 h，包合溫度-5℃，95%乙醇與尿素體積質(zhì)量比值5，混合脂肪酸與尿素質(zhì)量比值0.3。后對小鼠連續(xù)灌胃28 d不同劑量的花生油、核桃油及核桃油分離的亞油酸，研究其對小鼠體重、肝重、肝臟系數(shù)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和動脈硬化指數(shù)(AI)的影響。結(jié)果表明，與高脂模型組小鼠相比，核桃油分離的亞油酸顯著降低高脂小鼠體重、肝重及肝臟系數(shù)，降低高脂小鼠血清TC、TG水平，具有提高血液HDL-C 水平、降低LDL-C水平及AI的能力。