朱梓豪，羅光明，張風(fēng)波，張俊逸，柴華文，劉培培，王得運(yùn)，艾永強(qiáng)

(江西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，南昌 330004)

研究表明，肝臟疾病是對(duì)人類(lèi)健康造成損害的重要疾病之一，而肝內(nèi)免疫反應(yīng)是引起肝細(xì)胞損傷的重要原因[1]，其中T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的異常免疫應(yīng)答是引起肝細(xì)胞損傷及破壞的直接因素[2]。因此，多種免疫效應(yīng)細(xì)胞及細(xì)胞因子參與的免疫反應(yīng)在肝損傷的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。

梔子為市面上常見(jiàn)大宗藥材之一，來(lái)源于茜草科植物梔子(GardeniajasminoidesEllis)的干燥成熟果實(shí)[3]，性苦、味寒，具有瀉火除煩、涼血解毒的功效，主要含有環(huán)烯醚萜類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)和梔子黃色素等成分[4]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)梔子現(xiàn)代藥理研究及藥物開(kāi)發(fā)主要是針對(duì)環(huán)烯醚萜類(lèi)成分，少有對(duì)梔子油進(jìn)行藥理研究。本課題組前期建立四氯化碳致肝損傷模型，得到梔子油對(duì)四氯化碳所致急性肝損傷具有保護(hù)作用[5-6]，現(xiàn)采用刀豆蛋白A(ConA)建立免疫性肝損傷模型，探討梔子油對(duì)ConA誘導(dǎo)的免疫性肝損傷的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)KM雄性小鼠，體重16～20 g，共72只，由山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(魯)20140007。于江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)大樓動(dòng)物房飼養(yǎng)，自由進(jìn)食進(jìn)水，適應(yīng)3 d，動(dòng)物房溫度25～28℃，濕度35%～55%。

1.1.2 藥品與試劑

梔子，購(gòu)于江西省九江市湖口縣順昌梔子藥材基地，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源學(xué)科羅光明教授鑒定為茜草科植物梔子(GardeniajasminoidesEllis)的干燥成熟果實(shí)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT，批號(hào):20170611)、天門(mén)冬氨酸轉(zhuǎn)移酶(AST，批號(hào):20170607)、乳酸脫氫酶(LDH，批號(hào)：20170614)、一氧化氮(NO，批號(hào)：20170528)、超氧化物歧化酶(SOD，批號(hào):20170615)和丙二醛(MDA，批號(hào):20170610)試劑盒，均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。蘇木素-伊紅染液(批號(hào)：20170428)，購(gòu)于南京建成生物工程研究所，聯(lián)苯雙酯滴丸(生產(chǎn)批號(hào): 160605，每丸1.5 mg，購(gòu)于浙江萬(wàn)邦藥業(yè)股份有限公司)。

動(dòng)物組織總RNA 提取試劑盒，天根生物科技(北京)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：P4805；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，普洛麥格生物技術(shù)有限公司(USA)，生產(chǎn)批號(hào)：ADA5000 00002284267；內(nèi)參GAPDH、TNF-α、IFN-γ、CXCL-10引物，合成于捷瑞生物科技工程有限公司(上海)。引物具體序列見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.1.3 儀器與設(shè)備

DY89- II電動(dòng)勻漿機(jī)；UV-1800型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，島津公司(日本)；MULTISKAN GO酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技公司(上海)；Allegra64R 高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman公司；凝膠成像儀，美國(guó)BIO-RAD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 梔子油的提取

取干燥后的梔子藥材，粉碎后，過(guò)20目篩，加5倍量的石油醚，85℃索氏提取3 h，提取結(jié)束后旋蒸回收石油醚，得梔子油，稱(chēng)重并計(jì)算其得率，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

取60只昆明小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為空白組、免疫性肝損傷模型組、聯(lián)苯雙酯陽(yáng)性組(200 mg/kg)，梔子油低劑量組(0.3 g/kg)、梔子油中劑量組(0.6 g/kg)、梔子油高劑量組(1.2 g/kg)，梔子油劑量在得率及藥典梔子生藥推薦攝入量的基礎(chǔ)上得到，梔子油劑量組用0.5%吐溫-80溶液進(jìn)行溶解。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后開(kāi)始給藥，空白組和免疫性肝損傷模型組小鼠經(jīng)口灌胃0.5%吐溫-80溶液，其他各組小鼠灌胃相應(yīng)的藥物，每天1次，連續(xù)給藥10 d 。

1.2.3 免疫性肝損傷改良模型建立[7-8]

采用改良后的造模方法，連續(xù)給藥10 d，末次給藥1 h后，除空白組小鼠給予相同劑量的注射生理鹽水外，其余各組小鼠一次性尾靜脈注射ConA 15 mg/kg，禁食不禁水8 h，然后處理小鼠，取材檢測(cè)。

1.2.4 血清ALT、AST、LDH水平測(cè)定

造模后8 h，小鼠進(jìn)行摘眼球取血，4℃、全血3 000 r/min離心10 min，分離血清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中ALT、AST、LDH水平。

1.2.5 小鼠肝臟SOD、MDA、NO水平測(cè)定

小鼠取血后處死，取0.1 g肝臟組織，加4℃生理鹽水制成 10%的肝勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液，檢測(cè)SOD、MDA、NO水平。

1.2.6 肝臟病理學(xué)觀(guān)察

取小鼠相同部位的肝組織，用10%甲醛溶液固定，之后進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片展片、HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察肝組織病理學(xué)變化。

1.2.7 RT- PCR檢測(cè)肝臟組織中TNF-α、IFN-γ、CXCL-10 mRNA的表達(dá)水平

取小鼠相同部位肝組織，用動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以GAPDH作為參照基因進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)肝組織中TNF-α、IFN-γ、CXCL-10 mRNA的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)操作步驟均按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 梔子油對(duì)ConA致急性肝損傷小鼠血清ALT、AST、LDH水平的影響(見(jiàn)表2)

表2 梔子油對(duì)小鼠血清 ALT、AST 和LDH水平的影響 U/L

注：與空白組比較，△p<0.05，△△p<0.01，△△△p<0.001；與模型組相比，*p<0.05，* *p<0.01，* * *p<0.001。下同。

由表2可知，與空白組相比，模型組小鼠血清 ALT、AST及LDH水平極顯著升高(p<0.001)，具有顯著性差異，符合統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明免疫性肝損傷模型建造成功。與模型組相比，聯(lián)苯雙酯組小鼠血清中ALT、AST和LDH水平均極顯著下降(p<0.001)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；梔子油中、高劑量組小鼠血清中ALT、AST和LDH水平均具有顯著或極顯著性降低趨勢(shì)(p<0.05，p<0.001)，且高劑量組優(yōu)于中劑量組，呈劑量依賴(lài)性。表明梔子油對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷具有一定的保護(hù)作用。

2.2 梔子油對(duì)Con A致急性肝損傷小鼠肝臟組織NO、SOD和MDA的影響(見(jiàn)表3)

表3 梔子油對(duì)小鼠肝臟組織NO、SOD和MDA水平的影響

由表3可知，與空白組比較，模型組小鼠肝組織產(chǎn)生了明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)，表現(xiàn)在NO和MDA水平極顯著提高(p<0.001)，SOD活力極顯著降低(p<0.001)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組相比，梔子油低、中、高劑量組NO和MDA 水平顯著或極顯著降低(p<0.05,p<0.01,p<0.001)，SOD水平顯著或極顯著地升高(p<0.05,p<0.001)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，改善程度高劑量組優(yōu)于中低劑量組，呈劑量依賴(lài)性。

2.3 梔子油對(duì)ConA致急性肝損傷小鼠肝臟組織TNF-α 、CXCL-10、IFN-γ mRNA 表達(dá)的影響(見(jiàn)圖1)

由圖1可知，與空白組相比，急性免疫性肝損傷模型組小鼠肝臟組織 TNF-α、CXCL-10、IFN-γ mRNA的相對(duì)表達(dá)量發(fā)生極顯著性增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.001)。與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組小鼠肝組織中TNF-α、CXCL-10、IFN-γ mRNA的相對(duì)表達(dá)量極顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.001)；梔子油低、中、高劑量組均顯著或極顯著地降低了小鼠肝組織中 TNF-α、CXCL-10、IFN-γ mRNA的相對(duì)表達(dá)量，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05，p<0.01,p<0.001)。

2.4 肝臟病理學(xué)檢查(見(jiàn)圖2)

由圖2可知，光鏡下觀(guān)察空白組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞呈放射狀圍繞中央靜脈，排列整齊，匯管區(qū)無(wú)異常，未發(fā)生細(xì)胞壞死及炎性浸潤(rùn)現(xiàn)象。模型組小鼠肝組織出現(xiàn)明顯的肝小葉紊亂，細(xì)胞腫脹及浸潤(rùn)，排列無(wú)規(guī)律，肝組織嚴(yán)重?fù)p傷；聯(lián)苯雙酯組小鼠肝組織細(xì)胞變性、腫脹及壞死情況較模型組均不同程度改善，但仍有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與模型組比較，梔子油各劑量組小鼠肝組織損傷情況呈不同程度改善，肝小葉紊亂情況改良，細(xì)胞水腫及壞死情況均有不同程度減輕，細(xì)胞炎性浸潤(rùn)狀況也減弱，且高劑量組改善情況明顯優(yōu)于中、低劑量組，說(shuō)明梔子油對(duì)肝損傷具有保護(hù)作用且呈劑量依賴(lài)性。

2.5 討論

刀豆蛋白A為一種糖類(lèi)結(jié)合蛋白質(zhì)，是一種植物血凝素，具有強(qiáng)力的促進(jìn)有絲分裂作用，能較好地促淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)，其誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型與人體急慢病毒、自身免疫性缺陷導(dǎo)致的肝病相似[9]，是探討免疫性肝病機(jī)制及篩選抗肝損傷藥物的理想模型之一。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)設(shè)定梔子油3個(gè)給藥劑量，與模型組相比，梔子油各劑量組均能降低血清ALT、AST和LDH含量，提高肝臟SOD活性，降低肝組織NO、MDA的產(chǎn)生，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示肝組織中TNF-α、CXCL-10、IFN-γ mRNA的相對(duì)表達(dá)量降低，肝臟病理學(xué)觀(guān)察表明肝組織變性及壞死等病理癥狀明顯改善，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)趨勢(shì)，其保肝的機(jī)制可能與提高肝組織抗氧化酶體系活力，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎性因子表達(dá)有關(guān)。