姚思雯 朱科學(xué) 何佳麗

摘 要 為研究菠蘿蜜多糖（JFP-Ps）在體外模擬胃腸消化過程中抗氧化活性變化規(guī)律，通過模擬人體胃腸道消化模型，測定JFP-Ps體外消化產(chǎn)物對羥基自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2-·）以及1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical， DPPH·）的清除能力。研究結(jié)果表明，經(jīng)體外胃腸消化的JFP-Ps產(chǎn)物具有較強(qiáng)的·OH、O2-·和DPPH·清除能力。在模擬唾液消化15 min時，消化產(chǎn)物具有最大的·OH、O2-·和DPPH·清除活性；在模擬胃液消化4 h時，JFP-Ps有最大的·OH清除活性，而在模擬胃液1 h時有最大的O2-·和DPPH·清除活性；在模擬小腸液消化8 h時，消化產(chǎn)物具有最大的·OH、O2-·和DPPH·清除活性，說明JFP-Ps經(jīng)過體外模擬消化后仍然具有較強(qiáng)的·OH清除活性，且對其抗氧化活性具有促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞 菠蘿蜜多糖 ；體外消化 ；抗氧化活性 ；清除自由基

中圖分類號 Q964.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2019.02.013

Abstract An attempt was made to investigate the change of the antioxidant activities of polysaccharides from jackfruit （Artocarpus heterophyllus Lam） pulps （JFP-Ps） during simulated gastrointestinal digestion in vitro. The antioxidant activities of the digested products of JFP-Ps， including hydroxyl radical （·OH） scavenging capacity， superoxide anion radical （O2-·） scavenging capacity and 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH·） radical scavenging activity， were evaluated by simulating the digestion of human gastrointestinal tract in vitro. The evaluation found that during simulated gastrointestinal digestion in vitro the digested products of JFP-Ps had the ability of scavenging activities towards ·OH， O2-· and DPPH· radicals. When saliva digestion was simulated for 15min， the digested products had the highest ·OH， O2-· and DPPH· radical scavenging activities. When gastric digestion was simulated for 4 h， the digested products had the highest ·OH radical scavenging activities， while the highest O2-· and DPPH· radical scavenging activities were observed when gastric digestion was simulated for 1 h. And the digested products had the highest ·OH， O2-· and DPPH· radical scavenging activities when small intestinal digestion was simulated for 8 h. The results showed that after simulation of digestion in vitro JFP-Ps still exhibited strong ·OH radical scavenging activities and that their antioxidant activities were promoted.

Keywords polysaccharides from Artocarpus heterophyllus Lam. Pulp； digestion in vitro； antioxidant activity ； radical scavenging

多糖是由十個以上的單糖通過直鏈或支鏈糖苷鍵連接而成的天然高分子多聚物，廣泛存在于植物、動物和微生物中。目前，大量學(xué)者對多種多糖的體外消化進(jìn)行了廣泛研究，主要集中于多糖在消化模型中的性質(zhì)變化、生物活性變化以及結(jié)構(gòu)變化。梅娜娜等[1]研究發(fā)現(xiàn)，金釵石斛多糖在體外模擬消化過程中分子量降低，還原糖含量上升，但并未檢測到單糖。Hu和ding等[2-3]分別研究了大粒車前子多糖和靈芝多糖在體外模擬胃腸道消化模型中的消化作用，發(fā)現(xiàn)他們的分子量均降低。紅江蘺多糖、茯磚茶多糖和茶花多糖在模擬唾液、胃和小腸消化條件下沒有發(fā)生降解，分子量、單糖含量和還原糖含量無顯著變化[4-6]。

菠蘿蜜（Artocarpus heterophyllus Lam.）為桑科木菠蘿屬熱帶水果，種植于印度、孟加拉國、斯里蘭卡和中國南部等國家和地區(qū)[7-8]。菠蘿蜜具有抗氧化、抑菌抗炎、防齲、抗腫瘤、降血糖、降血脂、免疫調(diào)節(jié)和傷口愈合作用等多種功能活性，這些活性可能歸因于菠蘿蜜含有多種有益的化學(xué)成分，包括多糖類化合物、黃酮類化合物，甾醇類化合物和異戊二烯基黃酮類化合物等[9-12]。近年來，有關(guān)菠蘿蜜多糖（polysaccharide from jackfruit pulp， JFP-Ps）的報道主要集中在多糖的提取、理化性質(zhì)以及生理活性等方面。Tan等[10]研究發(fā)現(xiàn)，菠蘿蜜果肉中粗多糖具有免疫增強(qiáng)活性。朱科學(xué)等[12-13]優(yōu)化了水提醇沉法提取JFP-Ps的工藝，研究發(fā)現(xiàn)，JFP-Ps得率為6.18%，含有79.12%的總糖、5.83%的蛋白質(zhì)、15.65%的糖醛酸和15種氨基酸，且具有顯著的體外抗氧化活性；研究還發(fā)現(xiàn)，JFP-Ps的免疫活性增強(qiáng)可能與其促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖、提高抗氧化活性及誘導(dǎo)細(xì)胞因子 TNF-α、IFN-γ和 IL-1β分泌有關(guān)。

體外消化模型是通過模擬體內(nèi)消化生理條件研究食物的消化特性，已廣泛應(yīng)用于營養(yǎng)學(xué)、藥理學(xué)和食品化學(xué)等領(lǐng)域。目前，利用體外模擬人體胃腸道消化模型研究生物活性物質(zhì)消化后的抗氧化活性變化，已經(jīng)成為體外模擬人體消化技術(shù)的最新趨勢[14]。但有關(guān)JFP-Ps在體外消化模型中的抗氧化活性評價鮮有報道。因此，本實驗旨在通過體外模擬唾液、胃液以及小腸液消化的方法，評價JFP-Ps在消化過程中的抗氧化活性變化情況，以期為JFP-Ps在營養(yǎng)健康產(chǎn)品研發(fā)和膳食指導(dǎo)方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

菠蘿蜜多糖（polysaccharide from jackfruit pulp， JFP-Ps）主要由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和半乳糖醛酸組成，平均分子量為1668 kDa[11]，由香料飲料研究所產(chǎn)品加工研究課題組提供。

體外消化酶：胃蛋白酶（豬源）和胰酶（來源于豬胰腺）購自阿拉丁試劑有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl， DPPH）購自美國Sigma公司；鄰菲羅啉購自北京索萊寶科技有限公司；Tris（三羥甲基氨基甲烷）購自廣州賽國生物科技有限公司；磷酸二氫鉀，硫酸亞鐵，鄰苯三酚，無水乙醇，HCl和H2O2購自西隴科學(xué)股份有限公司；磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉購自廣州化學(xué)試劑廠。

1.1.2 儀器與設(shè)備

DK-98-IIA電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司生產(chǎn)；SHZ-B水浴恒溫振蕩器，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司生產(chǎn)；SPECORD 250PLUS紫外/可見分光光度儀，德國耶拿分析儀器股份公司生產(chǎn)；Master-s-plus UVF 全自動超純水系統(tǒng)，上海和泰儀器有限儀器公司生產(chǎn)；AL 104電子天平、FE20 pH計，梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

（1） JFP-Ps唾液消化研究

挑選健康的志愿者2人（年齡20～30歲），收集唾液前，志愿者禁止飲食和喝水，用水漱口30 s，以獲得中性的環(huán)境。然后將唾液在口腔聚集，受試者每隔60 s將其吐入試管，收集好的唾液4 000×g離心10 min以去除細(xì)胞，收集上清液備用。

分別取2 mL唾液置于8組試管，各加2 mL JFP-Ps溶液（4.0 mg/mL），用封口膜封口，充分混勻，37℃水浴進(jìn)行消化實驗，分別在5、10、15 、20、30 min和1 h取樣，樣品置于沸水浴滅酶15 min，將消化液用蒸餾水稀釋至1 mg/mL，于4 000 ×g離心10 min，取上清液-20℃保存?zhèn)溆?，實驗平行進(jìn)行3次。

（2） JFP-Ps體外模擬胃液消化研究

參照中國藥典方法配制人工胃液：取16.4 mL HCl于燒杯中，加800 mL蒸餾水和10 g胃蛋白酶，加水稀釋至1 000 mL，用1 mol/L NaHCO3調(diào)pH至（1.3±0.1），4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

JFP-Ps樣品溶液經(jīng)唾液消化15 min后分別加入等體積的人工胃液4 mL，密閉環(huán)境下于37℃水浴進(jìn)行胃液消化，分別在5、15、30 min、1 、2、4 h取出樣品于沸水浴中滅酶15 min，冷卻至室溫，1 mol/L NaHCO3調(diào)pH至7.0，4 000×g離心10 min，取上清液-20℃下保存?zhèn)溆?，實驗平行進(jìn)行3次。

（3） JFP-Ps在體外模擬小腸中的消化

參照中國藥典方法配制腸液：磷酸二氫鉀6.8 g，加500 mL蒸餾水溶解，用4%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至（6.8±0.1）。另取胰酶10 g，加適量蒸餾水溶解；再將兩液混合，加蒸餾水稀釋至1 000 mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

重復(fù)唾液和模擬胃液的消化過程，于37℃水浴中分別溫育15 min 和1 h后，取出樣品，然后分別加入人工腸液（反應(yīng)液與腸液體積比為10∶3），再置于37 °C恒溫條件下，分別反應(yīng)5、20 min和1、2、4、8 h，反應(yīng)結(jié)束后取出樣品于沸水浴中滅酶15 min， 4000 xg離心10 min，取上清液-20℃下保存?zhèn)溆?，實驗平行進(jìn)行3次。

1.2.2 JFP-Ps消化液抗氧化活性測定

（1） 羥基自由基清除作用研究

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有實驗數(shù)據(jù)均用Excel 2007、origin 8.5、SPSS 20.0等軟件處理完成。所有實驗結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（ x±s）表示。采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），Duncan檢驗，p<0.05時表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 JFP-Ps消化液對·OH的清除作用

JFP-Ps消化液對·OH的清除作用如圖1所示。體外模擬唾液消化過程中，JFP-Ps消化液對·OH的清除率在15 min內(nèi)升高，后略有降低并趨于穩(wěn)定，且在唾液消化15 min時，自由基清除率最大，為（84.61±0.34）%（圖1-A）。體外模擬胃液消化階段，JFP-Ps消化液的·OH清除率在5 min至4 h內(nèi)隨著消化時間的延長而呈增加趨勢，自由基清除率在胃液消化4 h時最大，為（89.93±0.36）%（圖1-B）。在體外模擬小腸液消化過程中，JFP-Ps消化液的 ·OH清除率在5 min至8 h內(nèi)隨著消化時間的增加而呈上升趨勢，在小腸液消化8 h時最大，為（95.51±3.61）%（圖1-C）。表明經(jīng)體外模擬胃腸消化的JFP-Ps消化產(chǎn)物對 ·OH有較強(qiáng)的清除能力。

2.2 JFP-Ps消化液對O2-·的清除作用

圖2-A是鄰苯三酚的自氧化曲線，吸光度值隨反應(yīng)時間的延長而穩(wěn)定增加，反應(yīng)體系的吸光度值與反應(yīng)時間線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.988 9。體外模擬胃腸道消化過程中JFP-Ps消化液O2-·清除規(guī)律如圖2-B～2-D所示。在體外模擬唾液消化過程中，JFP-Ps消化液O2-·清除率在15 min內(nèi)持續(xù)增加，而后清除率降低并趨于穩(wěn)定，在唾液消化15 min時，自由基清除率達(dá)到最大為（15.96±0.72）%。在體外模擬胃液消化過程中，JFP-Ps人工胃液消化產(chǎn)物O2-·清除率呈不規(guī)律變化，在胃液消化1 h時，清除率達(dá)到最大為21.38±1.74%。在體外模擬人工腸液消化1 h內(nèi)，自由基清除率持續(xù)降低，1～8 h內(nèi)呈上升趨勢，清除率在小腸液消化8 h時達(dá)到最大，為（59.74±3.12）%。結(jié)果表明JFP-Ps在唾液、胃液及腸液消化環(huán)境下消化產(chǎn)物均具有O2-·清除能力。

2.3 JFP-Ps消化液對DPPH·的清除作用

圖3顯示，JFP-Ps體外模擬胃腸道消化過程中DPPH·清除率的變化規(guī)律。體外模擬唾液消化15 min內(nèi)JFP-Ps消化液的DPPH·清除率持續(xù)增加，15 min至1 h內(nèi)隨著消化時間的延長自由基清除率降低并趨于穩(wěn)定，消化15 min時，自由基清除率達(dá)到最大，為（5.33±0.27）%。體外人工胃液模擬胃液消化1 h內(nèi)，JFP-Ps消化液的DPPH·清除率持續(xù)增加，1～4 h內(nèi)隨著消化時間的增加自由基清除率降低并趨于穩(wěn)定，自由基清除率在胃液消化1 h達(dá)到最大為（6.54±0.83）%。體外模擬人工腸液消化過程中，隨著消化時間的延長，消化產(chǎn)物DPPH·清除活性持續(xù)增加，清除率在小腸液消化8 h時達(dá)到最大，為（12.07±0.21）%。表明JFP-Ps胃腸液消化產(chǎn)物具有DPPH·清除能力。

3 討論與結(jié)論

化合物的抗氧化活性可歸因于多種機(jī)制：如破壞自由基鏈、防止自由基的引入、抑制脂質(zhì)過氧化物的分解、單線態(tài)氧猝滅、超氧離子清除等[18]?？赏ㄟ^羥基自由基清除率、DPPH自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率、ABTS自由基清除率以及還原能力等測定來評估和比較化合物的抗氧化性能。

·OH是活性氧物質(zhì)中最活潑的自由基，其半衰期非常短，大約為10-9 s，與靶分子之間反應(yīng)的速率很高，這使得其成為一種對生物分子造成嚴(yán)重?fù)p傷，對機(jī)體非常危險的化合物[19-21]。抗氧化劑對·OH的清除活性是評價其抗氧化活性的重要指標(biāo)。Zhu等[15]通過自由基清除活性研究菠蘿蜜多糖（JFP-Ps）體外抗氧化活性，結(jié)果表明，JFP-Ps（1 mg/mL）對·OH的清除率為68.30%。本實驗結(jié)果表明，唾液消化、人工胃液及人工腸液消化三個不同的消化階段中，JFP-Ps消化產(chǎn)物對·OH的清除能力與消化時間有一定的關(guān)系，在模擬唾液消化15 min，人工胃液消化4 h和人工腸液消化8 h時，JFP-Ps消化產(chǎn)物的 ·OH清除率達(dá)到最大，分別為（84.61±0.34）%、（89.93±0.36）%和（95.51±3.61）%，說明JFP-Ps經(jīng)過體外模擬消化后仍然具有較強(qiáng)的·OH清除活性，且對其抗氧化活性具有促進(jìn)作用。

O2-·是一種高毒性物質(zhì)，是分子氧單電子還原產(chǎn)生的一種陰離子自由基，可與其他分子相互作用產(chǎn)生活性氧物質(zhì)（ROS），如過氧化氫、羥基自由基和單線態(tài)氧，對生物體有害[18， 22]。O2-·在堿性條件下，鄰苯三酚發(fā)生自氧化反應(yīng)產(chǎn)生穩(wěn)定的O2-·與中間物，兩者又發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生一種在紫外有吸收的帶有顏色產(chǎn)物，通過325 nm波長處的吸光度值的線性積累，可反映抗氧化物質(zhì)O2-·清除能力的大小。本實驗發(fā)現(xiàn)，在唾液、人工胃液和人工腸液三個消化階段中，JFP-Ps消化產(chǎn)物對O2-·的清除率與消化時間相關(guān)，消化液的自由基清除率分別在唾液消化15 min、胃液消化1 h和小腸液消化8 h時達(dá)到最大，分別為（15.96±0.72）%、（21.38±1.74）%和（59.74±3.12）%，結(jié)果表明JFP-Ps經(jīng)過體外模擬消化后其消化產(chǎn)物具有O2-·清除活性。

DPPH·是一種穩(wěn)定的自由基，廣泛用于評價天然化合物的抗氧化活性[23]。抗氧化劑與DPPH·相互作用，可以將電子或氫原子轉(zhuǎn)移至DPPH·，形成穩(wěn)定的DPPH-H化合物，反應(yīng)物的顏色從暗紫色變?yōu)辄S色，并且其在517 nm波長處的吸光度值降低。吸光度值降得越快，表明物質(zhì)的抗氧化活性越強(qiáng)[24]。Vladimir Mihailovic等[25]研究表明，毛蕊花提取物經(jīng)過體外模擬胃腸道消化后，其DPPH·清除活性呈降低趨勢。Zhu等[15]研究表明，JFP-Ps在0.25～4 mg/mL對DPPH·的清除能力為（21.82%～69.64）%。本實驗結(jié)果顯示，JFP-Ps消化液的DPPH·清除率分別在唾液消化15 min、人工胃液消化1 h和人工腸液消化8 h時達(dá)到最大，為（5.33±0.27）%、（6.54±0.83）%和（12.07±0.21）%，表明消化作用降低了JFP-Ps的DPPH·清除率，研究結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致[26-28]。

在胃腸消化過程中，活性物質(zhì)可能受到pH、各種消化酶和溫度等因素的影響，使其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)發(fā)生變化，從而引起生物活性的變化[27， 29]。部分具有抗氧化活性的樣品經(jīng)體外消化后其抗氧化活性保持不變；而有一部分樣品消化后具有更高或更低的抗氧化活性，可能是由于這些化合物在消化過程中水解形成具有更高或更低抗氧化活性的其他代謝產(chǎn)物[30-31]。

基于體外模擬胃腸消化的方法能夠比較接近真實的生理消化過程，可用于研究天然產(chǎn)物多糖消化后抗氧化活性的變化規(guī)律。本文通過體外模擬胃腸消化研究JFP-Ps在消化過程中抗氧化能力的變化規(guī)律，研究發(fā)現(xiàn)JFP-Ps經(jīng)過體外模擬胃腸消化后，其消化產(chǎn)物仍然具有較強(qiáng)的·OH、O2-·和DPPH·清除活性。其中，在體外模擬唾液消化15 min時具有最大的·OH、O2-·和DPPH·清除活性；在體外模擬胃液消化4 h時具有最大的·OH清除活性，但在模擬胃液消化1 h時有最大的O2-·和DPPH·清除活性；在體外模擬小腸液消化8 h時具有對大的·OH、O2-·和DPPH·清除活性。本研究還發(fā)現(xiàn)，JFP-Ps經(jīng)體外模擬胃腸消化后，與未消化的JFP-Ps相比，消化產(chǎn)物具有更高的·OH清除活性和較低的DPPH·清除活性，可能是由于JFP-Ps消化后其結(jié)構(gòu)與化學(xué)性質(zhì)發(fā)生了變化。

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