許穎妍 胡計(jì)紅 楊惠婷

摘 要 以日本獨(dú)頭白菊‘精誠植株的頂芽、帶腋芽莖段為外植體進(jìn)行離體快繁研究。結(jié)果表明：以0.1% HgCl2為表面消毒劑，最適消毒時(shí)間為5 min，初代培養(yǎng)中，頂芽的培養(yǎng)效果比帶腋芽莖段更好；以頂芽為外植體，初代培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，其平均有效芽誘導(dǎo)數(shù)為5.87；在增殖培養(yǎng)中，以帶腋芽莖段誘導(dǎo)叢生芽，其最適增殖培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA，增殖系數(shù)為6.92；以葉片切段誘導(dǎo)不定芽，其最適增殖培養(yǎng)基為：MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA，增殖系數(shù)為3.59；以葉柄誘導(dǎo)不定芽，其最適增殖培養(yǎng)基為：MS+1.5 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA，增殖系數(shù)為0.49；最適生根培養(yǎng)基為：1/2MS+0.35 mg/L IBA，生根率100%。本研究結(jié)果可以為日本獨(dú)頭白菊‘精誠的工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)支持，具有重要的實(shí)踐價(jià)值。

關(guān)鍵詞 日本獨(dú)頭白菊‘精誠；芽誘導(dǎo) ； 生根 ；離體快繁

中圖分類號(hào) S336 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2019.02.008

Abstract In vitro rapid propagation of Japanese single-headed white chrysanthemum ‘Jingcheng was made by using apical buds and stem segments with axillary buds as explants. In primary culture， explants were best sterilized with 0.1% mercuric chloride as surface disinfectant for 5 minutes， and the apical buds had better culture results than the axillary buds. The optimal medium for culture of the apical buds was MS+ 0.5 mg/L 6-BA and 0.1 mg/L NAA， which induced 5.87 effective shoots by average. In proliferation culture， the shoots from the primary culture were cut into stem segments with axillary buds and induced to generate clustered shoots on the optimal medium of MS+1.0 mg/L of 6-BA+0.3 mg/L of NAA， and its multiplication coefficient was 6.92. The optimal medium for inducing adventitious shoots from the leaf was MS+1.0 mg/L of 6-BA+0.3 mg/L of NAA， and the multiplication coefficient of 3.59. The optimal proliferation medium for inducing adventitious shoots from the petioles of the leaves was MS+1.5 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA， and the multiplication coefficient was only 0.49. The optimum medium for root induction was 1/2 MS+0.35 mg/L IBA and the root inducing rate was upto 100%. These results will provide technical support for commercial production of elite seedlings of Japanese single-headed white chrysanthemum ‘Jingcheng， and has important practical value.

Keywords Japanese single-headed white chrysanthemum ‘Jingcheng； bud induction； root induction； rapid propagation in vitro

切花菊是菊科（Asteraceae）菊屬（Dendranthema）的多年生宿根草本花卉，既可盆栽觀賞，又可作鮮切花生產(chǎn)；切花菊的生產(chǎn)量占世界切花生產(chǎn)總量的30%，發(fā)展前景良好，具有很高的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值；生產(chǎn)中常采用扦插繁殖，其繁殖系數(shù)低，易感染病菌并引起觀賞品質(zhì)退化，且繁殖成本高。組織培養(yǎng)的主要目的之一是提高繁殖速率，用于重要品種的無性繁殖與無病原植物的生產(chǎn)[1]，既可以在短時(shí)間內(nèi)繁殖大量?jī)?yōu)質(zhì)花苗，又可以使染病植株脫出病毒恢復(fù)原有的優(yōu)良品質(zhì)。

近年來，已有學(xué)者通過組織培養(yǎng)繁殖切花菊，進(jìn)行工廠化育苗生產(chǎn)種苗降低種植成本[2]。福建省栽培的單頭切花菊品種主要有‘白扇、‘神馬和‘精誠?！\是近年來從日本引進(jìn)的單頭切花白菊新品種，其花形花色更優(yōu)，更耐寒，適合在福建省高海拔山區(qū)種植；供花期在清明節(jié)前后，可以填補(bǔ)‘白扇和‘神馬的市場(chǎng)空擋期。周婷[3]以‘白扇的頂芽和莖段為材料，建立了切花菊‘白扇的快繁體系；張?zhí)祆o等[4]、張?jiān)聥蒣5]、邱美歡等[6]在建立‘神馬組培快繁體系的過程中，均采用莖段作為外植體，能夠直接誘導(dǎo)不定芽的產(chǎn)生。目前針對(duì)‘精誠的組培快繁研究，還未見相關(guān)報(bào)道。

本研究分別采用‘精誠的頂芽、帶腋芽莖段、葉片、葉柄為材料，通過培養(yǎng)基配方的優(yōu)化，直接誘導(dǎo)不定芽或叢生芽，提高繁殖系數(shù)；通過生根條件優(yōu)化，提高組培苗的生根率和移栽成活率。本研究旨在建立單頭切花白菊‘精誠的組培快繁體系，打破優(yōu)質(zhì)種苗的國外壟斷，為引進(jìn)的優(yōu)良品種產(chǎn)業(yè)化提供優(yōu)質(zhì)種苗。

1 材料與方法

1.1 材料

菊花[Dendranthema grandiflorum（Ramat）Kitam.]‘精誠插穗由廈門琴鷺花卉合作社提供。

1.2 方法

1.2.1 無菌系建立

將插穗切成長約2.5 cm的切段，用洗衣粉洗滌插穗，流水沖洗30 min，蒸餾水沖洗3次，每次10 min；轉(zhuǎn)至超凈工作臺(tái)，用75%酒精浸泡30 s，無菌水沖洗1次，再用0.1% HgCl2分別浸泡3、5、7和9 min進(jìn)行消毒，無菌水沖洗5次，每次10 min；用濾紙吸干插穗表面水分，切掉底部與表面消毒劑接觸的部分（約0.5 cm），將頂芽和帶腋芽莖段分開接種于MS培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接種25瓶，3次重復(fù)；培養(yǎng)溫度（25±2）℃、光照強(qiáng)度2 000 lx左右、光照時(shí)間12 h/d（以下培養(yǎng)條件相同），除特殊說明外，MS及1/2 MS培養(yǎng)基中均附加蔗糖30 g/L，瓊脂7 g/L ，pH 5.8～6.0。接種20 d后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算污染率、死亡率、成功率，取平均值。

污染率=（外植體污染的個(gè)數(shù)/接種外植體總數(shù)）×100%

死亡率=（死亡的外植體個(gè)數(shù)/接種外植體總數(shù)）×100%

成功率=（外植體成活且未污染的個(gè)數(shù)/接種外植體總數(shù)）×100%

1.2.2 初代培養(yǎng)

剪取最適的外植體（頂芽或帶腋芽莖段），接種于含不同濃度6-BA（0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L）和NAA（0.05、0.10、0.15、0.20 mg/L）的MS培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接種25瓶，每瓶接種1個(gè)外植體，3次重復(fù)；接種后40 d統(tǒng)計(jì)高度大于2 cm的有效芽誘導(dǎo)數(shù)。

1.2.3 增殖培養(yǎng)

增殖培養(yǎng)均選取初代培養(yǎng)中長勢(shì)較一致的無菌苗。莖段增殖培養(yǎng)：將無菌苗剪成1.5 cm左右的帶腋芽莖段，接種于不同濃度6-BA（1.0、1.5、2.0 mg/L）和NAA（0.1、0.2、0.3、0.4 mg/L）組合的MS培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接種25瓶，每瓶接種4個(gè)外植體，3次重復(fù)；接種45 d后統(tǒng)計(jì)分析。

葉片增殖培養(yǎng)：取無菌苗頂端第1～2葉，將葉片切成0.5 cm×0.5 cm葉盤，葉背朝下，接種于不同濃度6-BA（0.5、1.0、2.0 mg/L）和NAA（0.1、0.2、0.3 mg/L）組合的MS培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接種20瓶，每瓶接種3個(gè)葉盤，3次重復(fù)；接種50 d后計(jì)算增殖系數(shù)。

葉柄增殖培養(yǎng)：取無菌苗頂端第1～2葉，切除葉片，保留葉柄，葉柄溝槽朝上，接種于6-BA（1.5 mg/L）和不同濃度NAA（0.05、0.10、0.15、0.20 mg/L）組合的MS培養(yǎng)基中；每個(gè)處理接種20瓶，每瓶接3個(gè)葉柄，3次重復(fù)； 50 d天統(tǒng)計(jì)分化率和增殖系數(shù)。

增殖系數(shù)=增殖后有效芽數(shù)/接種芽數(shù)。

分化率=（分化外植體總數(shù)/接種外植體總數(shù)）×100%

1.2.4 生根培養(yǎng)

選取繼代增殖長勢(shì)一致的無根苗，剪成3.5 cm長左右的插穗，接種于不同濃度的NAA（0、0.05、0.10、0.15 mg/L）或IBA（0、0.05、0.10、0.15 mg/L）組合的1/2 MS培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接20瓶，每瓶接3個(gè)插穗，3次重復(fù)；接種20 d后觀察無根苗的生根情況，計(jì)算生根率。

生根率=（生根的植株數(shù)/接種的植株總數(shù)）×100%

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)用方差法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 表面消毒時(shí)間對(duì)外植體的影響

如表1、2所示，消毒時(shí)間為3 min時(shí)，污染率最高，頂芽達(dá)到46.7%，腋芽達(dá)到50.2%；消毒時(shí)間為5 min時(shí)，成活率最高，頂芽為91.6%，腋芽為86.7%；消毒時(shí)間為9 min時(shí)，沒有外植體污染，但由于消毒時(shí)間較長，0.1% HgCl2對(duì)頂芽產(chǎn)生毒害，導(dǎo)致成活率最低，頂芽為55.6%，腋芽為52.9%。所以，當(dāng)選用頂芽或腋芽作為外植體時(shí)，0.1% HgCl2最佳的表面消毒時(shí)間為5 min。

2.2 初代培養(yǎng)中植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)頂芽誘導(dǎo)叢生芽的影響

以頂芽作為外植體，研究激素的濃度和配比對(duì)無菌芽苗誘導(dǎo)的影響。接種的外植體在第3天即可在切口處看到有淺綠色愈傷組織開始生成；5 d后可以觀察到頂芽開始萌發(fā)，外植體基部明顯膨大，10 d后可觀察到腋芽大量萌發(fā)（圖1-A）；第25天后無菌芽的生長速度逐漸變快；第35 天后，叢生芽生長速度逐漸減慢。

如表3所示，高濃度6-BA（≥1 mg/L）和NAA（≥0.20 mg/L）組合的培養(yǎng)基，容易誘導(dǎo)出大量的愈傷組織；當(dāng)6-BA濃度大于1.5 mg/L，誘導(dǎo)的芽苗出現(xiàn)玻璃化或葉片畸形；當(dāng)6-BA濃度為0.5 mg/L，NAA為0.10 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)的芽苗葉片濃綠、最健壯，有效芽最多（圖1-B）。所以，以單頭切花白菊‘精誠頂芽為外植體進(jìn)行初代培養(yǎng)，最佳的初代培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA。

2.3 增殖培養(yǎng)中植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)帶腋芽莖段誘導(dǎo)叢生芽的影響

據(jù)觀察，無菌苗第3天外植體的基部會(huì)有黃綠色的物質(zhì)產(chǎn)生，第7天莖尖向上生長，第15天基部有明顯增大的愈傷組織（圖2-A），莖尖伸長明顯，在靠近基部的腋芽開始萌發(fā)，第25 天萌發(fā)出大量健壯叢生芽，生長緩慢，第30天可看到叢生芽生長速度逐漸加快，第45天過后，叢生芽逐漸停止向上生長（圖2-B）。

如表4所示，處理3（1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA）長勢(shì)好，葉片濃綠且增殖系數(shù)最大，均值為6.92；處理1（1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA）生長狀況不好，增殖系數(shù)最低。所以，最佳的誘導(dǎo)叢生芽培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA。

2.4 增殖培養(yǎng)中植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)葉片誘導(dǎo)不定芽的影響

在葉片誘導(dǎo)不定芽過程中葉片先脫分化形成愈傷組織，再分化產(chǎn)生不定芽。接種至培養(yǎng)基第3 天切口部位有膨大跡象（圖3-A）；7 d葉片四周向內(nèi)卷曲形成愈傷組織；15 d后愈傷組織萌發(fā)出不定芽；20 d已萌發(fā)的不定芽長勢(shì)良好；30 d愈傷組織不再分化，大部分葉片萌發(fā)出不定芽（圖3-B）；40 d不定芽生長速度快，長勢(shì)良好；50 d不定芽逐漸停止生長。

如表5所示，處理1、2、6、和8均可直接誘導(dǎo)出不定芽，其中處理6大部分分化為不定芽，且不定芽強(qiáng)壯，長勢(shì)好，葉片濃綠；處理6的不定芽增殖系數(shù)最高，為3.59；處理2的不定芽增殖系數(shù)最低，僅為0.44。所以，葉片誘導(dǎo)不定芽最佳的培養(yǎng)基配方為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA。

2.5 增殖培養(yǎng)中植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)葉柄誘導(dǎo)不定芽的影響

在葉柄誘導(dǎo)不定芽過程中葉柄先脫分化形成愈傷組織，再分化產(chǎn)生不定芽。將葉柄接種至培養(yǎng)基配方為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA上，第3天葉柄切口部位有膨大跡象；第 7 天愈傷組織開始形成；第20 天愈傷組織為顏色逐漸變深，部分愈傷組織上開始萌發(fā)出不定芽（圖4-A）；第30 天愈傷組織顏色逐漸變黑，已萌發(fā)出的不定芽長勢(shì)良好（圖4-B）；第50天產(chǎn)生的不定芽逐漸停止生長。如表6所示，4個(gè)處理均能脫分化出愈傷組織，但僅處理3（1.50 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA）能分化出不定芽；在6-BA濃度為1.50 mg/L，NAA濃度為0.15 mg/L時(shí)，可以誘導(dǎo)出少量不定芽，增殖系數(shù)為0.49。所以，葉柄誘導(dǎo)不定芽的最適培養(yǎng)基為MS+1.50 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA。 2.6 在生根培養(yǎng)中NAA和IBA濃度對(duì)無根苗生根的影響

經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，添加植物生長調(diào)節(jié)劑處理的莖段在接種后第4天即可觀察到有根長出，接種15 d生根率均為100%（圖5-A、5-C），而未加植物生長調(diào)節(jié)劑的對(duì)照，生根率95%。生根的無菌苗經(jīng)過2 d煉苗后移栽進(jìn)穴盤（圖5-B）。如表7所示，綜合平均生根數(shù)、平均生根長度、根的生長情況以及試驗(yàn)成本進(jìn)行分析，最佳生根培養(yǎng)基配方為1/2 MS+0.05 mg/L IBA。

3 討論與結(jié)論

在菊花組培快繁技術(shù)過程中需要保證外植體無菌，并在無菌條件下進(jìn)行培養(yǎng)。外植體的消毒通常使用酒精、次氯酸鹽、氯化汞，本實(shí)驗(yàn)采用0.1%氯化汞，消毒5min成功率達(dá)90%以上，這與張?zhí)祆o等[4]實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同。在本研究中消毒3 min的外植體雖然是0致死率，但是此消毒時(shí)間可能不能殺死大部分的外植體表面和內(nèi)部菌，所以污染率高；消毒9 min時(shí)污染率為0但死亡率較高，可能在殺死菌類的同時(shí)也影響到外植體的活性。所以最適合的消毒時(shí)間為5 min，成活率達(dá)90%以上。

菊花的不同組織或器官均可作為菊花組培快繁的外植體，常用的外植體有頂芽、帶腋芽莖段、花蕾、花瓣、葉片等[7-11]。鐘海豐等[12]利用菊花‘繡球和‘妃子笑的幼芽和半木質(zhì)化的莖段作為外植體建立組培快繁體系，試驗(yàn)表明幼芽比半木質(zhì)化莖段更易誘導(dǎo)出有效芽；周婷在‘白扇的組培快繁研究中發(fā)現(xiàn)，以頂芽和帶腋芽莖段作為外植體誘導(dǎo)無菌苗時(shí)，頂芽比帶腋芽莖段誘導(dǎo)出的無菌苗更多[3]。本試驗(yàn)在建立單頭切花白菊‘精誠的無菌系時(shí)發(fā)現(xiàn)，頂芽比帶腋芽莖段更適合作誘導(dǎo)無菌苗的外植體，這是由于頂芽?jī)?nèi)源激素水平高，活力強(qiáng)，同時(shí)生長點(diǎn)受到葉片保護(hù)，消毒時(shí)受到的傷害小，這和周婷[3]的研究結(jié)果相同。

細(xì)胞分裂素與生長素在菊花植株再生中也起著至關(guān)重要的作用[13]。在植物組織培養(yǎng)中，常用的細(xì)胞分裂素有6-BA、KT等，生長素多用NAA、IAA、IBA[14]。高濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑會(huì)抑制無菌苗的產(chǎn)生，促進(jìn)愈傷組織的生成，會(huì)提高變異的機(jī)率，還會(huì)導(dǎo)致無菌苗畸形、玻璃化[15]；高濃度的細(xì)胞分裂素會(huì)導(dǎo)致組培中出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象[16]。本試驗(yàn)表明，高濃度的6-BA和NAA會(huì)誘導(dǎo)出大量愈傷組織，6-BA>1.5 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)出的組培苗玻璃化和葉片畸形的機(jī)率也會(huì)增加。

以葉片和葉柄作為增殖培養(yǎng)的材料，直接誘導(dǎo)不定芽，可減少試驗(yàn)步驟和繁殖時(shí)間，節(jié)約試驗(yàn)成本。徐清燏[17]采用葉片作為外植體誘導(dǎo)不定芽；蔣細(xì)旺等[18]采用不同菊花品種無菌苗的葉片誘導(dǎo)不定芽，結(jié)果表明，不同的品種葉片誘導(dǎo)出不定芽的能力有顯著的差別；張艷利[19]采用金盞菊生長期的葉柄誘導(dǎo)愈傷組織，結(jié)果表明，在激素6-BA和NAA共同作用下，愈傷組織分化效果較好；陳雪鵑等[20]以芙蓉菊的葉柄為外植體，通過不同濃度的6-BA和NAA誘導(dǎo)愈傷組織，試驗(yàn)結(jié)果表明葉柄產(chǎn)生的愈傷組織難以誘導(dǎo)出不定芽，所以不是所有菊花品種都可以用葉柄誘導(dǎo)出不定芽。本試驗(yàn)采用添加6-BA和NAA的MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)葉片和葉柄產(chǎn)生不定芽，葉片在6-BA 濃度為1.0 mg/L、NAA濃度為0.3 mg/L的MS培養(yǎng)基中，能誘導(dǎo)出不定芽，增殖系數(shù)為3.59；葉柄在6-BA 濃度為1.5 mg/L， NAA濃度為0.15 mg/L的MS培養(yǎng)基中，能誘導(dǎo)出少量不定芽，增殖系數(shù)為0.49。

在MS 、1/2 MS、1/4 MS培養(yǎng)基中均能誘導(dǎo)無菌苗生根。李露華[21]、王麗華[22]、肖秀麗[23]的試驗(yàn)中均表明，1/2 MS較適合組培苗生根。本試驗(yàn)采用1/2 MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的NAA和IBA，試驗(yàn)結(jié)果表明，IBA比NAA誘導(dǎo)生根的效果更好，這與周婷[3]、K. Waseem[24]的研究結(jié)果相同。

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