高琴琴，丁子桐，李友林，史 琦，苗 豐，石 璐，楚慧倫，孔德明，孫文燕*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥藥理系，北京 102488；2. 中日友好醫(yī)院中醫(yī)肺病二部，國家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)研究室(肺病慢性咳喘)，中醫(yī)藥防治過敏性疾病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(BZ0321)，中日友好醫(yī)院呼吸中心；國家呼吸疾病臨床研究中心，北京 100029)

支氣管哮喘是由多種炎性細(xì)胞及細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，是常見的慢性呼吸道疾病之一。該病嚴(yán)重威脅人們健康，且目前尚缺乏根治藥物。動(dòng)物模型是藥物評(píng)價(jià)的重要工具，卵蛋白(ovalbumin, OVA)致敏激發(fā)法是最常用的建立模型方法，但造模劑量不盡一致。許多哮喘模型OVA致敏劑量多在10～100 μg不等，其中以20、50、100 μg最為常見，但國內(nèi)外對(duì)不同致敏劑量的造模小鼠進(jìn)行對(duì)比的研究很少，且關(guān)于最佳OVA致敏劑量并無明確的報(bào)道。本研究基于文獻(xiàn)[1-3]，采用常用的三種劑量(20、50、100 μg)OVA復(fù)制BALB/c小鼠哮喘模型，通過觀察血清IgE、IL-4、IFN-γ的含量、支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophils，EOS)數(shù)量及肺組織病理變化情況，以探索較為合適的OVA劑量。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)6～8周齡BALB/c小鼠50只，體重18～20 g，雌雄各半，由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司提供[SCXK(京)2016-0002]。動(dòng)物飼養(yǎng)于中日友好醫(yī)院屏障環(huán)境中[SYXK(京)2016-0043]，溫度22℃～24℃，濕度44%～50%。本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)過中日友好醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審查，符合動(dòng)物保護(hù)、動(dòng)物福利和倫理原則，符合國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理相關(guān)規(guī)定，審查編號(hào)： 180105。本實(shí)驗(yàn)實(shí)施過程中嚴(yán)格遵守動(dòng)物使用的 3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

卵蛋白，北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)AH06C17666；4%氫氧化鋁凝膠，Thermo公司，批號(hào)：SH255260；醋酸地塞米松，天津力生制藥股份有限公司，批號(hào)：1705021；小鼠IgE、IL-4、IFN-γ酶聯(lián)免疫試劑盒，聯(lián)科生物。

402B型超聲霧化器，江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司；Multiskan MK3全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀，Thermo公司，USA；DH4000 A電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津泰斯特。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組

隨機(jī)將動(dòng)物分為5組，即正常組，模型1組(OVA 20 μg)，模型2組(OVA 50 μg)，模型3組(OVA 100 μg)，醋酸地塞米松組(OVA 100 μg)，每組10只，雌雄各半。

1.3.2 哮喘模型的復(fù)制

BALB/c小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，采用OVA和氫氧化鋁凝膠腹腔注射及OVA霧化激發(fā)方法建立支氣管哮喘模型。具體方法及時(shí)間節(jié)點(diǎn)見表1。

在第22～28天，各模型組與醋酸地塞米松組每天霧化吸入1% OVA 30 min，正常組每天霧化吸入生理鹽水30 min。醋酸地塞米松組在霧化前1 h灌胃給藥醋酸地塞米松(0.5 mg/kg)，其余各組灌胃生理鹽水。

表1 BALB/c小鼠支氣管哮喘模型建立方法(n=10)

1.3.3 血清IgE、IL-4、IFN-γ的含量測定

第29天，各組小鼠眼球取血，3000 r/min 離心 10 min，取血清，采用ELISA法檢測血清中IgE、IL-4、IFN-γ的含量。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.3.4 支氣管肺泡灌洗液(BALF)EOS計(jì)數(shù)

鈍性分離頸部組織，暴露氣管，在氣管上剪一個(gè)T型小口，插入靜脈留置針軟管，用注射器注入0.8 mL生理鹽水，重復(fù)3次。將收集到的BALF 2500 r/min離心5 min，將沉淀涂片，進(jìn)行瑞氏染色，高倍鏡下計(jì)數(shù)EOS。

1.3.5 肺組織病理學(xué)觀察

取小鼠右肺，福爾馬林固定24 h，脫水后石蠟包埋、切片、HE染色。每組隨機(jī)選取6只，在光學(xué)顯微鏡下(200倍)觀察小鼠肺組織的病理變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

對(duì)模型3組、醋酸地塞米松組進(jìn)行兩組間差異性比較：若服從正態(tài)分布且方差齊采用t檢驗(yàn)；數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布或方差不齊采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P<0.05或P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察

BALB/c 小鼠在致敏時(shí)無顯著特征，經(jīng)卵蛋白激發(fā)后出現(xiàn)呼吸急促、弓背直立、躁動(dòng)撓鼻、二便失禁等典型表現(xiàn)。

2.2 各組小鼠血清中IgE、IL-4、IFN-γ含量比較

與正常組比較，模型1、2、3組小鼠血清IgE、IL-4、IFN-γ含量均明顯升高(P<0.05或P<0.01)，IL-4/IFN-γ比值顯著降低(P<0.05或P<0.01)；與模型3組比較，醋酸地塞米松組血清IgE、IFN-γ含量明顯下降(P<0.05)，IL-4/IFN-γ比值顯著升高(P<0.05)。見表2。

2.3 各組小鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)

與正常組比較，模型1、2、3組小鼠BALF中EOS數(shù)明顯升高(P<0.05)；與模型3組相比，醋酸潑尼松組BALF中EOS數(shù)有下降趨勢(P>0.05)。見表3。

2.4 肺組織病理學(xué)觀察

三種不同劑量的卵蛋白均可造成小鼠肺組織炎細(xì)胞浸潤、淋巴濾泡形成、支氣管上皮細(xì)胞變性、支氣管平滑肌增生等病理損害。模型2組(OVA 50 μg)較模型1組(OVA 20 μg)、3組(OVA 100 μg)支氣管平滑肌增生及黏膜皺襞損傷更為嚴(yán)重。醋酸地塞米松組較模型3組上述病理損害明顯減輕。見表4，圖1。

表2 各組小鼠血清中IgE、IL-4、IFN-γ含量及IL-4/IFN-γ比值比較

注：與正常組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型3組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the normal group,△P<0.05，△△P<0.01. Compared with the model 3 group,*P<0.05,**P<0.01.

表3 各組小鼠BALF中EOS數(shù)量比較

注：與正常組比較，△P<0.05.

Note. Compared with the normal group,△P<0.05.

表4 各組小鼠肺組織病理變化比較

3 討論

哮喘的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，動(dòng)物模型的不斷研究及優(yōu)化為進(jìn)一步研究其發(fā)病機(jī)制提供客觀有效的手段。目前用于制作哮喘模型的動(dòng)物多采用BALB/c小鼠[3]，常用的模型制備方法是采用OVA和氫氧化鋁致敏及OVA霧化吸入激發(fā)，但采用OVA制作哮喘模型的方法存在很大的差異，致敏劑量多在10～100 μg不等，國內(nèi)外關(guān)于最佳OVA致敏劑量并無明確的報(bào)道，綜合近五年的文獻(xiàn)，多使用20、50、100 μg的OVA進(jìn)行致敏。如房祥峰[4]，劉家齊等[5]采用20 μg OVA輔以氫氧化鋁致敏小鼠；張明強(qiáng)[2]，劉瑞等[6]采用50 μg OVA輔以氫氧化鋁致敏小鼠；程勝[3]，謝林艷等[7]采用100 μg OVA輔以氫氧化鋁致敏小鼠。

本研究基于上述等近年來的文獻(xiàn)分析，選用三種劑量的OVA進(jìn)行致敏激發(fā)。隨著IgE和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)的升高，導(dǎo)致氣道管腔狹窄，支氣管平滑肌增生，氣道上皮細(xì)胞變性，支氣管及血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤，杯狀細(xì)胞增生并分泌大量黏液，使得平滑肌的敏感性增高，導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性，從而引起肺組織病理改變以及呼吸急促、躁動(dòng)撓鼻、二便失禁等癥狀。因此，哮喘模型的成功主要從小鼠的癥狀、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)、氣道病理改變以及血清IgE、IL-4、IFN-γ含量變化等幾個(gè)方面來評(píng)價(jià)，以此來評(píng)估哮喘發(fā)病過程中的氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應(yīng)性，從而探索較為合適的OVA劑量。

IgE可介導(dǎo)Ⅰ型超敏反應(yīng)，使嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放多種炎癥介質(zhì)加重哮喘炎癥反應(yīng)[5]。本研究結(jié)果顯示三組哮喘模型小鼠血清中IgE均明顯升高；而陽性藥醋酸地塞米松組與模型3組相比，IgE水平降低，表明其可降低IgE介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)。

炎癥反應(yīng)在哮喘發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用，EOS作為哮喘中氣道炎癥、超敏反應(yīng)及組織損傷等病理過程的主要效應(yīng)細(xì)胞，參與哮喘的炎癥過程[8]。本研究收集BALF并檢測其中EOS，發(fā)現(xiàn)模型1、2、3組哮喘模型小鼠EOS較正常組升高。

輔助性T細(xì)胞亞群Th2的免疫增強(qiáng)在哮喘的發(fā)生、發(fā)展起著主導(dǎo)作用[9]。Th2主要分泌IL-4、IL-5等細(xì)胞因子，而Th1主要分泌IL-2、INF-γ等細(xì)胞因子。本研究中3個(gè)模型組較正常組IL-4均顯著升高。經(jīng)典理論認(rèn)為Th1/Th2失衡是哮喘發(fā)病的關(guān)鍵機(jī)制，但近年來較多研究發(fā)現(xiàn)哮喘的發(fā)病機(jī)制已不能單純用Th1/Th2平衡理論來解釋。研究者用特異性抗原在體外分離哮喘患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞，檢測發(fā)現(xiàn)上清液中IFN-γ和IL-4水平均增高，提示哮喘患兒體內(nèi)Th1和Th2細(xì)胞功能均增強(qiáng)；而且在哮喘緩解期患者外周血中淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ較特應(yīng)癥患者及正常人明顯增多[10]。本研究中以IFN-γ為代表的Th1細(xì)胞因子顯著升高，與上述結(jié)果一致。因此，不能只考慮用Th1/Th2平衡理論來解釋哮喘的發(fā)病機(jī)制，需要進(jìn)行更多的探索完善，近年來研究較多的有Th17/Treg平衡、TGF-/TrSmads[11]及VEGF/MMP[12]信號(hào)通路等。

組織形態(tài)學(xué)是評(píng)價(jià)哮喘模型是否成功的重要指標(biāo)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，3個(gè)模型組的肺組織病理切片可見大量的炎性細(xì)胞浸潤，支氣管管腔內(nèi)可見黏液栓，上皮細(xì)胞變性，黏膜皺襞改變及支氣管平滑肌增生等表現(xiàn)，與哮喘患者的病理特征相似；模型2組(50 μg)BALB/c小鼠較模型1組(20 μg)、模型3組(100 μg)在支氣管平滑肌增生及黏膜皺襞變化方面更為顯著。

綜上所述，本研究采用三種劑量OVA誘導(dǎo)的BALB/c小鼠哮喘模型均獲成功，但綜合而言50 μg OVA所誘發(fā)的哮喘模型血清IgE、IL-4、IFN-γ含量以及肺組織病理改變更為明顯，可用于哮喘相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究。醋酸地塞米松可減少IgE分泌、降低血清炎性細(xì)胞因子含量，減輕肺組織病理變化，可作為陽性藥使用。