閆彩燕 ，吳則東 ，興旺 ，邳植

（1.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點實驗室，哈爾濱150080；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所/黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱 150080；3.黑龍江省甜菜工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 150080）

0 引言

我國甜菜遺傳育種等研究采用常規(guī)手段取得了一定進展[1]，但甜菜分子標(biāo)記的開發(fā)與利用落后于玉米、大豆、水稻、棉花等主要農(nóng)作物。近些年，分子標(biāo)記技術(shù)已逐步應(yīng)用到了甜菜種質(zhì)資源評價和輔助育種等多個方面。諸如，遺傳圖譜和指紋圖譜的構(gòu)建[2-4]、遺傳多樣性的評估[5-6]、親緣關(guān)系及基因流動[7-8]的評價等。

小衛(wèi)星區(qū)域DNA直接擴增（direct amplification ofminisatellite DNA by PCR，簡稱DAMD-PCR），1993年首次由Health等[9]提出，即以小衛(wèi)星的核心序列為引物直接進行PCR擴增的一種技術(shù)。目前，DAMD-PCR技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于多種作物進行相關(guān)的研究。胡建斌等[10]建立了黃瓜的DAMD反應(yīng)體系，并且只利用3條DAMD引物就可以將20份黃瓜材料進行分辨；Métais等人[11]評價了DAMD-PCR與ISSR、RAPD、RFLP以及AFLP等在菜豆的遺傳多樣性方面的差異，結(jié)果表明DAMD-PCR的多態(tài)性水平能夠達到40%，由于DAMD-PCR擴增的位點數(shù)量較少，因此單獨應(yīng)用DAMD-PCR檢測栽培豆科間遺傳變異的能力有限；王掌軍等[12]利用引物YNZ22一次就鑒別了21個甜瓜品種；Ince等[13]開發(fā)了辣椒的DAMD-PCR引物；Karaca等[14]利用DAMDPCR對鼠尾草進行了基因分型。目前DAMD-PCR在甜菜上應(yīng)用卻不多，興旺等[15]、孫燕紅等[16]已經(jīng)初步建立了甜菜DAMD的PCR優(yōu)化體系，用聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖凝膠電泳的檢測具有制作方便、檢測簡單等優(yōu)點，但尚未對甜菜DAMD的應(yīng)用進行深入的研究。利用DAMD-PCR等分子標(biāo)記技術(shù)進行甜菜品種鑒定的工作仍然較少，針對甜菜品種鑒定的高效鑒定引物仍有待開發(fā)，相應(yīng)的檢測技術(shù)流程仍有待優(yōu)化。本實驗分析兩種不同的擴增程序?qū)μ鸩薉AMD-PCR擴增產(chǎn)物的影響。并對其結(jié)果進行了比較分析，從而確定了更適合于甜菜DAMD-PCR引物擴增的程序，以便使DAMD-PCR在甜菜上得到更好的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

①實驗材料：實驗中用到的品種均來自國外種子公司，種子的品種名稱及編號見表1。

②引物：實驗中選用的引物均來源于相關(guān)文獻，引物名稱及序列見表2。

表1 本實驗選用的甜菜品種名稱及其編號Table 1 Name and number of sugar beet varieties selected in this experiment

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取

將甜菜種子播種于營養(yǎng)缽內(nèi)，在晝夜溫度 25 ℃，光照 280 μmol/(m2·s)，光周期 14 h/10 h的培養(yǎng)室中發(fā)芽。待幼苗長至4～5片真葉時，將葉片和下胚軸一同取下，采用改良CTAB法[17]提取基因組DNA，利用核酸蛋白測定儀檢測提取的DNA濃度和純度。最后，將提取的DNA稀釋至10 ng/μL，待用。

表2 實驗中用到的引物名稱及其序列Table 2 Primer names and their sequences used in the experiment

1.2.2 PCR程序

常規(guī)PCR程序：94℃預(yù)變性3min；隨后35個循環(huán)，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s；最后72℃延伸5min。

降落 PCR（touchdown PCR，簡稱 TD-PCR）程序：94℃預(yù)變性 3 min；94℃變性 15 s，退火 15 s，72℃延伸30 s，20個循環(huán)，退火溫度從65～55℃，每降一度兩個循環(huán)；之后25個循環(huán)，退火溫度保持55℃；最后72℃延伸5min。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠檢測

采用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對擴增的產(chǎn)物進行分離。采用快速銀染法[18]進行染色。顯影結(jié)束后進行拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

常規(guī)PCR擴增程序和touchdown PCR程序擴增結(jié)果，見圖1和圖2。從圖1和圖2的對比可清楚地看出，6個引物在不同的退火溫度下均擴增出了條帶，但常規(guī)程序擴增的非特異帶較多，不易于識別。相反，相對于常規(guī)PCR而言，touchdown PCR電泳結(jié)果條帶明亮、清晰，沒有彌散條帶[19]。這6條DAMD引物均表現(xiàn)出了較好的多態(tài)性，每種引物以8個品種DNA為模板均擴增出了不同的帶型，暗示單獨利用這8個引物中的任意一種均能夠鑒別出這8個品種。

圖1 常規(guī)PCR程序甜菜DAMD擴增產(chǎn)物的結(jié)果Fig.1 Results of beet DAMD am plification by conventional PCR

圖1 TD-PCR程序甜菜DAMD擴增產(chǎn)物的結(jié)果Fig.1 Results of beet DAMD amp lification by TD-PCR

在常規(guī)PCR程序擴增條件下，使用FCIIeX8、URP6R、FVIIe8C、HBV5和HBV3引物擴增出的條帶較多。其中，URP6R和FVIIe8C擴增的條帶數(shù)目最多，條帶數(shù)量在20個左右。FCIIeX8、HBV5和HBV3擴增的條帶數(shù)量次之，條帶數(shù)量為10～15個。URP6R擴增的條帶數(shù)目最少，在常規(guī)PCR程序擴增時僅有2～4個條帶。與常規(guī)PCR程序相比，touchdown PCR程序有助于提高特異性條帶豐度。尤其是在使用URP13R引物進行擴增時，品種1～6均有新的特異性條帶出現(xiàn)。其他引物對特異性條帶的擴增效率也有不同程度的提高。使用touchdown PCR程序還有助于減少非特異條帶數(shù)量。在使用URP6R、FVIIe8C和HBV5引物對6個品種進行檢測時，與常規(guī)PCR程序相比非特異性條帶數(shù)量明顯減少。

3 討論

TD-PCR是1991年由Don R H等人[20]提出，其基本原理是設(shè)計一系列從高到低的退火溫度，設(shè)計的最高退火溫度高于引物的Tm值，伴隨著循環(huán)的進行，退火溫度會降到與Tm值相同的溫度，這樣就確保了引物和模板的第一次雜交事件發(fā)生在最互補的反應(yīng)物之間，伴隨著退火溫度的降低，雖然最終退火溫度低于引物的Tm值，但是由于特異性的反應(yīng)底物占據(jù)優(yōu)勢，因此最終產(chǎn)物仍然是以特異性產(chǎn)物為主[21]。TD-PCR可在不確定退火溫度的情況下擴增出較為理想的條帶[22]。Xiong等[23]在花生的DAMD擴增體系中將退火溫度設(shè)定為50℃；Misra等[24]在苜蓿的DAMD擴增體系中設(shè)定退火溫度為50℃；Bhattacharyya等[25]在金釵石斛的DAMD擴增體系中則設(shè)定退火溫度為54℃；而本實驗中即使將這些引物的退火溫度提高到55℃，仍然產(chǎn)生了很多非特異性擴增的條帶，說明不同的引物在不同作物上的使用退火溫度會有所不同。本文通過利用touchdown PCR對6個不同DAMD-PCR引物進行擴增，均獲得了理想的條帶，說明在不確定引物退火溫度的情況下或者同時擴增多個不同退火溫度的引物時，可以采用TD-PCR程序?qū)⑼嘶饻囟葟母叩降瓦M行降落，從而達到獲得較為理想擴增結(jié)果的目的。