洪 鐵 *，何麗明 ，劉 放 ，郭 敏

(1.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，長(zhǎng)春130012；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，長(zhǎng)春130021；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，長(zhǎng)春130118）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是人類(lèi)中最常見(jiàn)的關(guān)節(jié)炎形式，一種關(guān)節(jié)整體的退行性疾病。其特征主要在于對(duì)關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨、韌帶、關(guān)節(jié)囊、滑膜和關(guān)節(jié)周?chē)∪獾挠绊憽Ｒ蚱洳∫蚣白饔脵C(jī)制不清楚，早期診斷和治療均存在問(wèn)題，需要進(jìn)一步深入研究[1]。寄生壯骨顆粒是吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院骨科專(zhuān)家以傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，在長(zhǎng)期臨床實(shí)踐中總結(jié)出的經(jīng)驗(yàn)方。全方由桑寄生、威靈仙、獨(dú)活、秦艽、白芷、防風(fēng)、赤芍、延胡索等多味中藥組成。寄生壯骨顆粒在多年臨床治療骨關(guān)節(jié)炎疾病方面取得了較好的療效。本研究探討了寄生壯骨顆粒對(duì)木瓜蛋白酶誘導(dǎo)大鼠骨關(guān)節(jié)炎的影響，以期為寄生壯骨顆粒治療骨關(guān)節(jié)炎提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)Wistar大鼠，雄性，50只，體質(zhì)量210～250 g，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（遼）2015-0001，將動(dòng)物于動(dòng)物室適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，溫度為20～25℃，濕度為60%～70%，12h明暗交替照明，給予維持飼料，自由飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

木瓜蛋白酶、L-半胱氨酸由北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)；鹽酸氨基葡萄糖膠囊由北京康必得藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；大鼠白介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒、大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒、大鼠白細(xì)胞介素-6(IL-6)ELISA試劑盒由上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供；大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）、基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13）ELISA試劑盒由武漢默沙克生物科技有限公司提供；糖胺聚糖試劑盒由上海通蔚科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，Biotek公司；手持式高速勻漿機(jī)，上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司；BS124S電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；3-18k低溫高速冷凍離心機(jī)，Sigma公司；XPX-9052 MBE數(shù)顯不銹鋼電熱培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司。

2 方法

2.1 分組給藥與動(dòng)物模型的建立

將50只Wistar雄性大鼠，隨機(jī)分成6組，模型組10只，其它各組每組8只，分籠飼養(yǎng)。分別為正常對(duì)照組，模型組（10%木瓜蛋白酶+0.03mol/L L-半胱氨酸），鹽酸氨基葡萄糖陽(yáng)性藥對(duì)照組0.13g/kg，寄生壯骨顆粒高劑量組8.69g/kg生藥、中劑量組4.35g/kg生藥、低劑量組2.12g/kg生藥。

將10%木瓜蛋白酶與0.03 mol/L的L-半胱氨酸按1∶1混合靜置30 min后備用。在實(shí)驗(yàn)第0、3、6天，模型組，陽(yáng)性藥對(duì)照組，寄生壯骨顆粒高劑量組、中劑量組、低劑量組給藥組大鼠膝關(guān)節(jié)腔注入0.2 mL混合溶液誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎模型[2]。正常對(duì)照組注射等體積生理鹽水。在末次注射木瓜蛋白酶混合溶液后，分別給予給藥組灌胃陽(yáng)性藥及三個(gè)濃度的受試藥物，模型組、正常對(duì)照組灌服等體積的生理鹽水，每天一次，共計(jì)4周。

2.2 觀測(cè)指標(biāo)

2.2.1 大鼠一般情況

觀察各組大鼠精神狀態(tài)、毛發(fā)、進(jìn)食量及活躍狀態(tài)程度。

2.2.2 大鼠體重變化及雙膝關(guān)節(jié)寬度

觀察并記錄大鼠實(shí)驗(yàn)周期的體重變化。測(cè)量造模前、給藥前，以及給藥第 1、2、3、4周的踝關(guān)節(jié)寬度，取3次測(cè)量的平均值，按照以下公式計(jì)算出關(guān)節(jié)腫脹度。

關(guān)節(jié)腫脹度(mm)=致炎后（給藥后）踝關(guān)節(jié)寬度-致炎前踝關(guān)節(jié)寬度

2.2.3 血清中 IL-6、IL-1β、TNF-α 的含量測(cè)定

大鼠麻醉后腹主動(dòng)脈取血，血液至少靜置45min，4℃，3500r/min， 離心 15min， 分離血清分裝-80℃凍存。采用ELISA試劑盒測(cè)量血清IL-6、IL-1β、TNF-α的水平。

2.2.4 血清中MMP-3、MMP-13的含量測(cè)定

采用ELISA試劑盒測(cè)量血清MMP-3、MMP-13的水平。

2.2.5 滑膜組織中糖胺多糖含量測(cè)定

取稱(chēng)量好的滑膜組織，加入冰生理鹽水，置于冰浴中用組織勻漿器制成2%滑膜組織勻漿，在4℃下，3500 r/min，離心10 min。取上清液，采用二甲基亞甲藍(lán)分光光度法測(cè)定糖胺多糖的含量。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0軟件進(jìn)行，根據(jù)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)資料的正態(tài)性和方差齊性，各組數(shù)據(jù)均用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)比較差異的顯著性。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般情況

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，各組實(shí)驗(yàn)大鼠膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度正常，局部無(wú)腫脹，皮毛光滑，靈敏度佳，精神狀態(tài)及飲食、飲水能為正常。

造模過(guò)程中未出現(xiàn)大鼠死亡。造模結(jié)束后的大鼠除正常對(duì)照組行動(dòng)正常，其余各組表現(xiàn)精神不振，膝關(guān)節(jié)稍有跛行。治療4周后正常對(duì)照組大鼠膝關(guān)節(jié)活動(dòng)正常，飲食、飲水正常，毛色光亮，反應(yīng)靈敏；模型組的大鼠均出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)局部腫脹，少動(dòng)，飲食、飲水減少，反應(yīng)遲純等。其它給藥組大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹度，活動(dòng)情況，飲食、飲水量，反應(yīng)敏捷性均有不同程度的減輕。

3.2 大鼠體重變化、雙膝關(guān)節(jié)寬度的結(jié)果

各組大鼠造模后第1周內(nèi)體重增長(zhǎng)緩慢，第2周體重開(kāi)始恢復(fù)，第3周至第4周實(shí)驗(yàn)結(jié)束體重開(kāi)始逐漸增長(zhǎng)。所有造模動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)初期起始體重與正常對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，實(shí)驗(yàn)第2周開(kāi)始，與正常對(duì)照組相比，模型組體重顯著降低 (P＜0.05)，與模型組相比，各給藥組大鼠體重明顯升高，結(jié)果見(jiàn)表1。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,正常對(duì)照組實(shí)驗(yàn)前后膝關(guān)節(jié)直徑無(wú)變化。與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)直徑顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，陽(yáng)性藥對(duì)照組、寄生壯骨顆粒高劑量組的膝關(guān)節(jié)直徑顯著降低 （P＜0.01），寄生壯骨顆粒中、低劑量組的膝關(guān)節(jié)直徑明顯降低（P＜0.05），結(jié)果見(jiàn)表 2。

表1 寄生壯骨顆粒對(duì)大鼠體重的結(jié)果 （±s）

表1 寄生壯骨顆粒對(duì)大鼠體重的結(jié)果 （±s）

注：與正常對(duì)照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

表2 寄生壯骨顆粒對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹度的結(jié)果（±s）

表2 寄生壯骨顆粒對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹度的結(jié)果（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

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3.3 血清中 IL-6、IL-1β、TNF-α 的結(jié)果

與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α 含量顯著升高（P﹠0.01）；與模型組相比，陽(yáng)性藥對(duì)照組、寄生壯骨顆粒高劑量組的IL-6、IL-1β、TNF-α含量顯著降低（P﹠0.01），寄生壯骨顆粒中、低劑量組的 IL-6、IL-1β、TNF-α 含量明顯降低 （P﹠0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 寄生壯骨顆粒對(duì)大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α含量結(jié)果

3.4 血清中MMP-3、MMP-13的結(jié)果

與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠血清中MMP-3、MMP-13含量顯著升高（P﹠0.01）；與模型組相比，陽(yáng)性藥對(duì)照組、寄生壯骨顆粒高劑量組的MMP-3、MMP-13含量顯著降低（P﹠0.01），寄生壯骨顆粒中、低劑量組的 MMP-3、MMP-13含量明顯降低 （P﹠0.05），結(jié)果見(jiàn)表 4。

表4 寄生壯骨顆粒對(duì)大鼠血清中MMP-3、MMP-13含量結(jié)果

3.5 滑膜組織中糖胺多糖含量測(cè)定

與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠滑膜組織糖胺多糖含量顯著降低（P﹠0.01）；與模型組相比，陽(yáng)性藥對(duì)照組、寄生壯骨顆粒高劑量組的糖胺多糖含量顯著升高（P﹠0.01），寄生壯骨顆粒中、低劑量組的糖胺多糖含量明顯升高（P﹠0.05），結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 寄生壯骨顆粒對(duì)大鼠滑膜組織糖胺多糖的結(jié)果

4 討論

骨性關(guān)節(jié)炎好發(fā)于膝關(guān)節(jié)、脊柱及手指關(guān)節(jié)等部位，是以關(guān)節(jié)軟骨退變和骨質(zhì)增生為基本特征的慢性進(jìn)行性骨關(guān)節(jié)疾病。隨著全球老齡化的加劇，骨性關(guān)節(jié)炎已成為加重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)、影響人們生活質(zhì)量的社會(huì)性問(wèn)題[3]。

TNF-α在骨性關(guān)節(jié)炎的基本病理過(guò)程中起著直接促進(jìn)軟骨基質(zhì)降解及軟骨細(xì)胞的破壞的作用，同時(shí)TNF-α誘導(dǎo)生成IL-6、IL-1β的炎癥因子能加重關(guān)節(jié)滑膜的炎癥反應(yīng)。本研究中我們發(fā)現(xiàn)模型組TNF-α、IL-6、IL-1β的含量均升高；與模型組相比，寄生壯骨顆粒治療后，TNF-α、IL-6、IL-1β 均有所下降，其中以寄生壯骨顆粒高劑量組治療效果最為明顯。

在骨性關(guān)節(jié)炎病變過(guò)程中，關(guān)節(jié)軟骨的損害首先是軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中膠原的破壞，且以Ⅱ型膠原為主，在關(guān)節(jié)軟骨退變嚴(yán)重的區(qū)域，以膠原酶和基質(zhì)溶解素等為代表的MMPs類(lèi)的活性最高[4]，其中MMP-3、MMP-13在骨性關(guān)節(jié)炎的疾病中表達(dá)增高。本文研究表明寄生壯骨顆粒治療組使MMP-3、MMP-13表達(dá)量顯著降低。

軟骨中蛋白聚糖的合成不足是軟骨退變的主要表現(xiàn)之一，而糖胺多糖是蛋白聚糖的最主要成分[5]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示寄生壯骨顆粒能顯著提高組織中糖胺多糖的含量。

綜上所述，寄生壯骨顆粒在減輕木瓜蛋白酶誘導(dǎo)大鼠骨關(guān)節(jié)炎的同時(shí)，降低TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-3、MMP-13的表達(dá)，提高糖胺多糖含量。提示寄生壯骨顆粒治療木瓜蛋白酶誘導(dǎo)大鼠骨關(guān)節(jié)炎可能是從下調(diào)促炎因子的表達(dá)、抑制金屬蛋白酶產(chǎn)生、增加糖胺多糖的含量來(lái)治療骨關(guān)節(jié)炎。關(guān)于寄生壯骨顆粒在減輕木瓜蛋白酶誘導(dǎo)大鼠骨關(guān)節(jié)炎的機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。