徐 瑩,李 春,操 軒

(湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院/湖北省黃石市中心醫(yī)院腎內(nèi)科 435000)

糖尿病腎病(diabetes nephrosis，DN)是由糖尿病引起的腎臟損害，是糖尿病患者死亡的主要原因之一。DN的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，涉及的因素也很多，目前研究發(fā)現(xiàn)代謝紊亂、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的異常激活和氧化應(yīng)激等均與DN的發(fā)生、發(fā)展有一定關(guān)系。氧化應(yīng)激與DN關(guān)系極為密切，高濃度的葡萄糖可引起氧化應(yīng)激[1]；同時(shí)，過(guò)量的糖可與長(zhǎng)壽命的蛋白質(zhì)(如膠原)結(jié)合，形成穩(wěn)定的晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycationend products，AGEs)，AGEs隨之可引起氧化應(yīng)激[2]。腎小球系膜細(xì)胞(renal mesangial cells，RMCs)是腎小球的固有細(xì)胞之一，可控制腎小球血流，并對(duì)腎小球毛細(xì)血管起支架和保護(hù)作用。糖尿病時(shí)，AGEs的加速形成和累積可促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，隨后腎小球系膜擴(kuò)張，發(fā)生腎小球硬化，逐漸演變?yōu)镈N[3-4]。

乙二醛酶Ⅰ( glyoxalase Ⅰ，GLOⅠ)是人體內(nèi)主要的α羰基醛解毒酶，其主要作用為催化甲基乙二醛(MG)轉(zhuǎn)化為乳酸，從而減少AGEs生成，起到對(duì)AGEs的解毒作用。GLOⅠ與糖尿病的視網(wǎng)膜損傷、大血管損傷和周圍神經(jīng)病變等有關(guān)[5-7]。但目前關(guān)于GLOⅠ在DN中的具體作用及分子機(jī)制的研究并不深入?；诖耍疚氖紫葯z測(cè)了DN患者尿液中GLOⅠ水平的變化，隨后分析GLOⅠ敲減對(duì)AGEs所誘導(dǎo)的人腎小球系膜細(xì)胞(human renal mesangial cells，HRMCs)氧化應(yīng)激的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 人腎小球系膜細(xì)胞HRMCs購(gòu)自美國(guó)Scien Cell研究實(shí)驗(yàn)室，培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基[含10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素和100 μg /mL鏈霉素]；FBS購(gòu)自以色列BI公司；AGEs購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；RNA提取試劑Trizol和轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；H2DCFDA試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司；P22phox和GAPDH引物購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative polymerase chain reaction，Q-PCR)試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；總p38抗體、磷酸化p38(p-p38)抗體、總AKT抗體、AKT 308位蘇氨酸磷酸化(308Thr)抗體，AKT 473位絲氨酸磷酸化(473Ser)抗體、內(nèi)參β-actin抗體、HPR標(biāo)記的二抗均購(gòu)自美國(guó)CST公司；P22phox抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；GLOⅠ小干擾RNA(siRNA)序列由江蘇庫(kù)美生物設(shè)計(jì)合成；ECL化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。

1.2尿液標(biāo)本收集 參與研究的2型糖尿病患者選自湖北省黃石市中心醫(yī)院住院患者，在收集尿樣之前患者均已知情同意。樣本分類根據(jù)糖尿病患者的臨床特征，共分為4個(gè)研究亞組：C組(對(duì)照組)為無(wú)糖尿病的健康個(gè)體，共35例；DM組為無(wú)糖尿病腎病的2型糖尿病患者，共34例，其尿清蛋白/肌酐比值(ACR)<30 mg/g；DN low組為有微量蛋白尿(ACR 30～300 mg/g)的2型糖尿病腎病患者，共18例； DN high組為有大量蛋白尿(ACR>300 mg/g)的2型糖尿病腎病患者，共22例。

1.3尿液GLOⅠ水平檢測(cè) GLOⅠ水平采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法(德國(guó)默克)測(cè)定，檢測(cè)儀器為美國(guó)Biorad公司iMARK 680 酶標(biāo)儀。

1.4脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 接種HRMCs于24孔板或6孔板中，無(wú)雙抗培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)70%左右，棄去培養(yǎng)基，每孔加入無(wú)血清無(wú)雙抗培養(yǎng)基200 μL或500 μL，37 ℃孵育30 min。24孔板每孔加入5 μg siRNA、5 μL Lipofectamine 2000和90 μL無(wú)血清無(wú)雙抗培養(yǎng)基，6孔板每孔加入15 μg siRNA、15 μL Lipofectamine 2000和470 μL無(wú)血清無(wú)雙抗培養(yǎng)基，37 ℃孵育5 h后更換為完全培養(yǎng)基，經(jīng)相應(yīng)處理后進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.5ROS活性檢測(cè)(H2DCFDA熒光探針標(biāo)記法) HRMCs接種于96孔板內(nèi)，不同處理因素處理8 h后，棄去細(xì)胞上清液，加入200 μL H2DCFDA探針(濃度為10 μmol /L)，37 ℃避光環(huán)境下繼續(xù)孵育20 min，熒光顯微鏡下檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS變化并成像記錄。

1.6Q-PCR Trizol法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。隨后以cDNA 為模板進(jìn)行Q-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系為10 μL：上、下游引物各0.4 μL、ddH2O 3.2 μL、SYBR Green 5.0 μL、cDNA 1.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 20 s，66 ℃ 10 s，3次循環(huán)；95 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，70 ℃ 1 s，39次循環(huán)，延伸末尾采集熒光；65～95 ℃熔解曲線分析，計(jì)算目的基因表達(dá)水平。

1.7Western blot HRMCs經(jīng)不同處理因素處理48 h后，蛋白裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，電轉(zhuǎn)移至聚二偏氟乙烯(PVDF)膜上，在含5%牛血清清蛋白(BSA)的TBST中封閉1 h，加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌3次，加入相應(yīng)HPR標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育1 h，最后進(jìn)行ECL顯影分析。

2 結(jié) 果

2.1GLOⅠ檢測(cè) 經(jīng)ELISA檢測(cè)，與C組比較，DM組、DN low組、DN high組患者尿液中GLOⅠ水平逐漸下降，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。

**：P<0.01，*：P<0.05

圖1 4組人群尿液GLOⅠ水平檢測(cè)(ELISA)

2.2利用siRNA對(duì)HRMCs中GLOⅠ進(jìn)行有效敲減 為了分析和確認(rèn)GLOⅠ在DN中的作用，筆者選取腎小球系膜細(xì)胞HRMCs，設(shè)計(jì)了3條針對(duì)GLOⅠ的siRNA(分別命名為siGLOⅠ-1、 siGLOⅠ-2和siGLOⅠ-3)，根據(jù)轉(zhuǎn)染的siRNA將細(xì)胞分為：Blank組(未作任何處理)、NC組(轉(zhuǎn)染無(wú)意義siRNA)、siGLO-1組(轉(zhuǎn)染siGLOⅠ-1)、siGLO-2組(轉(zhuǎn)染siGLOⅠ-2)、siGLO-3組(轉(zhuǎn)染siGLOⅠ-3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：3條siRNA均可實(shí)現(xiàn)對(duì)HRMCs中GLOⅠ的敲減，其中以siGLOⅠ-3的敲減效果最為明顯(圖2)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均選用siGLOⅠ-3。

圖2 Westen blot驗(yàn)證siRNA對(duì)GLOⅠ敲除效果

2.3GLOⅠ敲減可進(jìn)一步增強(qiáng)AGEs所誘導(dǎo)的HRMCs細(xì)胞內(nèi)ROS活性 H2DCFDA 熒光探針標(biāo)記檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：與Blank組比較，200 μg/mL的AGEs(AGEs組)可導(dǎo)致HRMCs細(xì)胞氧化應(yīng)激增加，HRMCs細(xì)胞內(nèi)ROS活性上升。而與AGEs組比較，GOLⅠ(AGE+siGOLⅠ3)則可進(jìn)一步增強(qiáng)由AGEs所誘導(dǎo)的HRMCs細(xì)胞內(nèi)ROS活性(圖3)。

圖3 GLOⅠ敲減對(duì)HRMCs細(xì)胞內(nèi)ROS活性的影響

2.4GLOⅠ敲減可促進(jìn)AGEs所誘導(dǎo)的P22phox表達(dá) Q-PCR和Western blot檢測(cè)均發(fā)現(xiàn)：與Blank組比較，200 μg/mL的AGEs(AGEs組)可誘導(dǎo)P22phox的表達(dá)，而GLOⅠ敲減(AGE+siGOLⅠ3組)可使AGEs所誘導(dǎo)的P22phox mRNA和蛋白表達(dá)均進(jìn)一步增加(圖4)。結(jié)合ROS活性檢測(cè)結(jié)果可知，GLOⅠ敲減可促進(jìn)AGEs所誘導(dǎo)的HRMCs細(xì)胞氧化應(yīng)激。

A：GLOⅠ敲減對(duì)AGEs作用下細(xì)胞P22phox mRNA表達(dá)的影響(Q-PCR，**：P<0.01)；B：GLOⅠ敲減對(duì)AGEs作用下細(xì)胞P22phox蛋白表達(dá)的影響(Western blot)

圖4 GLOⅠ敲減對(duì)AGEs作用下HRMCs細(xì)胞P22phox的影響

圖5 GLOⅠ敲減對(duì)AGEs誘導(dǎo)的AKT信號(hào)和p38信號(hào)蛋白的影響

2.5GLOⅠ敲減可促進(jìn)AGEs所誘導(dǎo)的PI3K/AKT信號(hào)和p38信號(hào)蛋白的活化 本研究利用Western blot檢測(cè)了GLOⅠ敲減對(duì)AGEs誘導(dǎo)的PI3K/AKT信號(hào)和p38信號(hào)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與AGEs組比較，GLOⅠ敲減可使AGEs誘導(dǎo)的AKT磷酸化和p38磷酸化進(jìn)一步增加(圖5)。

3 討 論

氧化應(yīng)激是指機(jī)體在內(nèi)源性或外源性有害因素的刺激下，體內(nèi)高活性分子如ROS等產(chǎn)生過(guò)多，體內(nèi)的抗氧化和氧化兩大系統(tǒng)平衡失調(diào)，機(jī)體更加傾向于氧化，并最終導(dǎo)致組織及細(xì)胞損傷。氧化應(yīng)激使機(jī)體處于高度易損狀態(tài)，持續(xù)的氧化應(yīng)激與多種疾病如高血壓、潰瘍性結(jié)腸炎、腦缺血再灌注損傷、阿爾海默茨癥、腫瘤等密切相關(guān)[8-13]。氧化應(yīng)激在DN的發(fā)生、發(fā)展中也起著重要作用，葡萄糖本身可誘發(fā)氧化應(yīng)激，葡萄糖與長(zhǎng)壽命的蛋白質(zhì)結(jié)合所形成的晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)也是誘發(fā)氧化應(yīng)激的重要因素。當(dāng)血糖正常時(shí)，AGEs形成非常緩慢。在長(zhǎng)期的高血糖糖化反應(yīng)的作用下，引起原本形成非常緩慢的AGEs 的加速形成和累積。AGEs與糖尿病慢性并發(fā)癥有關(guān)，也與其他疾病如衰老、老年癡呆等有相關(guān)性[14-15]。AGEs水平的上升也會(huì)導(dǎo)致腎小球系膜細(xì)胞的氧化應(yīng)激，引起腎小球正常濾過(guò)功能的缺失，最終導(dǎo)致糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展[3-4]。

GLOⅠ作為甲基乙二醛(methylglyoxal，MG)最重要的降解酶之一，可降低作為非酶糖化反應(yīng)中間體MG的含量，從而減少非酶糖化蛋白如AGEs的生成，可保護(hù)機(jī)體免受AGEs所致的慢性損傷。研究證實(shí)，在人血管內(nèi)皮細(xì)胞中過(guò)表達(dá)GLOⅠ可逆轉(zhuǎn)高糖所誘導(dǎo)血管生成減少和AGEs的累積[16]，GLOⅠ對(duì)高糖所致的神經(jīng)損傷也具有保護(hù)作用[17]。在GLOⅠ轉(zhuǎn)基因大鼠中，GLOⅠ對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎臟損傷有明顯保護(hù)作用，大鼠的各種腎損傷指標(biāo)均明顯降低[18]。反之，在非糖尿病大鼠中敲除GLOⅠ基因后，會(huì)使大鼠腎臟表現(xiàn)出與DN相似的病理表現(xiàn)[19]，由此提示GLOⅠ表達(dá)水平的改變與DN的發(fā)生密切相關(guān)。本研究則進(jìn)一步表明：GLOⅠ在DN患者尿液中含量降低，同時(shí)在人腎小球系膜細(xì)胞HRMCs中，GLOⅠ敲減會(huì)增加AGEs作用下的細(xì)胞氧化應(yīng)激，在機(jī)制研究中，則證明PI3K/AKT和p38信號(hào)途徑與之相關(guān)，因此，GLOⅠ的確可能是與DN相關(guān)的重要分子。

總之，本研究表明GLOⅠ的降低可以引起腎小球系膜細(xì)胞HRMCs的氧化應(yīng)激，這可能是導(dǎo)致DN發(fā)生的關(guān)鍵原因之一。GLOⅠ可作為DN發(fā)生和治療的潛在新靶點(diǎn)，用于DN的早期診斷和病情評(píng)估，但目前對(duì)于GLOⅠ在DN中具體作用并未完全明確。雖然本研究證實(shí)了GLOⅠ可影響PI3K/AKT信號(hào)和p38信號(hào)蛋白，但是GLOⅠ導(dǎo)致HRMCs細(xì)胞氧化應(yīng)激的機(jī)制遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒(méi)有闡明，后續(xù)將進(jìn)一步分析DN患者血液和尿液GLOⅠ的變化，并探討GLOⅠ與其他信號(hào)蛋白ERK1/2等的關(guān)系，以便為深入解析GLOⅠ在DN中的作用奠定基礎(chǔ)。